潘冬瑞　李嘯　張瑤　李知洪　俞學(xué)鋒

摘 要：主要研究Zn2+對(duì)基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)鹵醇脫鹵酶的影響。以鹵醇脫鹵酶活力為響應(yīng)值，通過單因素試驗(yàn)篩選出顯著影響因子Zn2+，并確定其最優(yōu)濃度為0.000 7 g·L-1；在50 L罐中進(jìn)行分批發(fā)酵試驗(yàn)，比較分析鹵醇脫鹵酶活力、OD600以及在線參數(shù)OUR、CER等的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)Zn2+可顯著促進(jìn)重組大腸桿菌生長，提高生長速率，酶活提高了5.4%。

關(guān)鍵詞：鹵醇脫鹵酶；鋅離子；大腸桿菌；發(fā)酵調(diào)控

中圖分類號(hào)：R378.2+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.08.002

鹵醇脫鹵酶也叫鹵醇-鹵化氫裂解酶，通過分子內(nèi)親核取代機(jī)制催化鄰鹵醇轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物和鹵化氫，是微生物降解此類化合物的關(guān)鍵酶之一，在治理環(huán)境污染方面具有十分重要作用。此外，在催化環(huán)氧化物和鄰鹵醇之間的轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，鹵醇脫鹵酶具有很高的立體選擇性，因而在手性藥物合成方面也有廣闊的應(yīng)用前景。序列同源性搜索以及二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，鹵醇脫鹵酶的結(jié)構(gòu)相似于短鏈脫氫酶/還原酶家族（SDRs），它的3個(gè)重要的催化殘基分別是：L-Tyr145、L-Ser132和L-Arg149[1-2]。鹵醇脫鹵酶是目前世界范圍內(nèi)的一個(gè)新的研究領(lǐng)域，目前的研究均僅限于鹵醇脫鹵酶基因的改造和優(yōu)化，對(duì)于大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)鹵醇脫鹵酶的影響因素及過程調(diào)控的研究甚少。

微生物在生長繁殖和產(chǎn)酶過程中，需要無機(jī)鹽維持細(xì)胞的滲透壓，并合成核酸等生命物質(zhì)；某些微量元素如錳、鋅、鐵等對(duì)其生理活性物質(zhì)（酶的活性中心或輔酶）的組成，或生理活性作用調(diào)節(jié)物（酶的激活劑）的作用有重要影響[3]。

關(guān)于Zn2+在生物界中重要性上的認(rèn)識(shí)是個(gè)漫長的經(jīng)歷[4]，包括農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)，最后在近100年來，發(fā)現(xiàn)在人體生長發(fā)育過程中，Zn2+在生理功能上和營養(yǎng)作用上具有極為重要的意義，從生命遺傳物質(zhì)核酸到代謝參與物—酶，都有Zn2+的作用，因而研究學(xué)者稱其為“生命的火花”。但是，Zn2+在微生物代謝過程中的作用等相關(guān)研究在國內(nèi)外成果不多，此方面研究有著十分重要的意義。

筆者主要對(duì)Zn2+在大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)鹵醇脫鹵酶的過程進(jìn)行研究，以確定影響菌體生長及鹵醇脫鹵酶表達(dá)的Zn2+的最優(yōu)百分比，并通過多參數(shù)相關(guān)分析的方法，探究Zn2+對(duì)鹵醇脫鹵酶生物合成影響的原理，為后續(xù)發(fā)酵過程優(yōu)化以及生產(chǎn)放大奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 重組大腸桿菌E.coli P84A/MC1061，由安琪酵母股份有限公司菌種室提供。

1.1.2 試 劑 L-阿拉伯糖L（+）-Arabinose，購于Sigma公司。酵母浸出物FM888由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)。其它試劑均為分析純AR。

1.1.3 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基（g·L-1）：甘油8，酵母浸出物（FM888）25，NaCl 6.0，KH2PO4 2.5，K2HPO4 2.5，Na2HPO4 5.0，MgSO4·7H2O 1.0，瓊脂粉15。搖瓶液體培養(yǎng)基（g·L-1）：甘油4，酵母浸出物50，NaCl 2.0，KH2PO4 6.5，K2HPO4 6.5，Na2HPO4 3.5，MgSO4·7H2O 1.5，微量元素2。50 L發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基（g·L-1）：甘油12，酵母浸出物50，NaCl 2.0，KH2PO4 6.5，K2HPO4 6.5，Na2HPO4 3.5，MgSO4·7H2O 1.5。

1.1.4 誘導(dǎo)劑溶液 L-阿拉伯糖濃度0.05 g·mL-1。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng) 種子培養(yǎng)：將斜面菌樣接入裝有25 mL液體培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，在30 ℃和200 r·min-1搖床上培養(yǎng)20 h。發(fā)酵培養(yǎng)及誘導(dǎo)產(chǎn)酶：將種子液接入發(fā)酵搖瓶后，在30 ℃，200 r·min-1條件下培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液OD600達(dá)到2時(shí)，加入0.5 mL·L-1阿拉伯糖溶液，發(fā)酵結(jié)束后收集菌體。

1.2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng) 1級(jí)種子培養(yǎng)：將斜面菌樣接入裝有25 mL液體培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，制備2瓶，在30 ℃和200 r·min-1搖床上培養(yǎng)24 h。2級(jí)種子培養(yǎng)：將2 mL 1級(jí)種子瓶菌樣，接入裝有100 mL液體培養(yǎng)基的1 L的三角瓶中，制備6瓶，在30 ℃和200 r·min-1搖床上培養(yǎng)20 h。發(fā)酵罐分批發(fā)酵培養(yǎng)：滅菌前加入15 mL消泡油，滅菌后將6瓶2級(jí)種子液合并，接入裝有30 L液體培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐中，在30 ℃、260 r·min-1、0.035 MPa下培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液OD600達(dá)到2時(shí)，加入配制好的L-阿拉伯糖溶液。

1.3 發(fā)酵罐調(diào)控添加策略

pdr2罐未加入Zn2+；pdr3罐配底料時(shí)加入篩選出的最優(yōu)濃度（0.000 7 mol·L-1）的Zn2+。

1.4 測定項(xiàng)目及方法

1.4.1 測定項(xiàng)目：pH、OUR、CER、RQ、溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、空氣壓力、空氣流量、溶解氧等。發(fā)酵過程中每1 h測1次OD600，每2 h測1次氨基氮和銨根離子，每4 h測1次鹵醇脫鹵酶酶活和胞內(nèi)胞外Zn2+的含量。

1.4.2 測定方法 菌體量測定方法見參考文獻(xiàn)[5]。鹵醇脫鹵酶酶活力測定方法見參考文獻(xiàn)[6]。鋅離子含量測定用原子吸收法測定[7]。氨基氮測定用甲醛滴定法[8]。用靛酚藍(lán)-分光光度法測定銨根離子[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶試驗(yàn)

2.1.1 篩選顯著影響因子 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一些微量元素對(duì)酶的生理活性物質(zhì)（酶的活性中心或輔酶）的組成或生理活性作用的調(diào)節(jié)物（酶的激活劑）的作用有重要影響，基于李建華等[3]對(duì)于影響鹵醇脫鹵酶活力的6種金屬離子：Zn2+ 、Co2+、Fe2+、Ca2+、Mn2+和Cu2+的考察，選擇其中較顯著的3種影響因子Zn2+、Co2+和Fe2+進(jìn)行深入篩選，在離子濃度0，0.000 2，0.000 4，0.000 6，0.000 8，0.001 0，

0.001 2 g·L-1 7個(gè)濃度下比較，3種金屬離子在不同濃度下的OD600與鹵醇脫鹵酶活力的變化趨勢如圖1和圖2。

相對(duì)空白組而言，F(xiàn)e2+、Zn2+ 和Co2+對(duì)菌體的生長都有一定程度的促進(jìn)作用，但Zn2+對(duì)重組大腸桿菌的生長的促進(jìn)影響更為顯著（見圖1），且在Zn2+ 濃度為0.000 6 g·L-1菌體濃度達(dá)到最大。另外，加Zn2+組對(duì)鹵醇脫鹵酶活力的提高也最為顯著（見圖2），Zn2+ 濃度在0.000 8 g·L-1時(shí)酶活最高。綜上所述，無論是對(duì)重組大腸桿菌菌體生長，還是鹵醇脫鹵酶活力的影響上看，最顯著影響因子為Zn2+，因此后續(xù)研究工作圍繞Zn2+展開。

2.1.2 顯著因子Zn2+最優(yōu)濃度的確定 為進(jìn)一步找到更準(zhǔn)確的Zn2+最優(yōu)濃度，接下來的研究將縮小濃度梯度，在離子濃度0，0.000 6，0.000 7，

0.000 8，0.000 9，0.001 0 g·L-1 6個(gè)濃度下比較，結(jié)果見圖3。

由圖3知，縮小Zn2+濃度梯度后，各試驗(yàn)組中0.000 7 g·L-1濃度下的Zn2+對(duì)重組大腸桿菌生長和鹵醇脫鹵酶活力的影響更為顯著，Zn2+最優(yōu)濃度為0.000 7 g·L-1。

2.2 50 L pdr2、pdr3發(fā)酵罐分批發(fā)酵結(jié)果

在50 L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批發(fā)酵試驗(yàn)，添加Zn2+的策略如1.3所示。

兩種控制策略下重組大腸桿菌表達(dá)鹵醇脫鹵酶的發(fā)酵過程比較如圖4、5和6所示。

由圖4可知，兩罐前2 h的延滯期基本相同，3～7 h pdr3 罐（在底料中加入了最優(yōu)濃度的Zn2+）的生長速率明顯高于pdr2罐，并在7 h達(dá)到最大菌濃。由圖5知，發(fā)酵前16 h pdr3 罐的鹵醇脫鹵酶酶活相對(duì)于pdr2罐均有一定程度的提高，最大酶活由90 715.60提升至95 590.88，提高了5.4%，而后8 h的酶活兩罐相差不大。pdr3 罐與pdr2 罐比較，其合成最大酶活所需的時(shí)間由16 h縮減至12 h。

由圖6知，兩罐的OUR和CER的趨勢基本相似，但pdr3罐對(duì)應(yīng)的呼吸強(qiáng)度略大于pdr2罐，代謝更為旺盛；而對(duì)于呼吸熵RQ曲線，pdr3罐的曲線可近似看做是pdr2罐對(duì)應(yīng)的曲線向前平移約3 h所得。

由此推知，Zn2+通過提高重組大腸桿菌E.coli P84A/MC1061的生理活性和生長速率，同時(shí)提高其生物積累量而提高了鹵醇脫鹵酶的表達(dá)量。

3 結(jié)論與討論

綜合以上搖瓶試驗(yàn)和50 L發(fā)酵試驗(yàn)可知，在底料中加入Zn2+，重組大腸桿菌E.coli P84A/MC1061的生理活性和生長速率得到了明顯提高，菌體的生物積累量增加，鹵醇脫鹵酶的表達(dá)量增加，最大酶活由90 715.60提升至95 590.88，提高了5.4%，且最大酶活表達(dá)時(shí)間提前約4 h。

關(guān)于Zn2+生物學(xué)功能方面的報(bào)道很多。從20世紀(jì)60年代開始，如Vallee B L等[10]許多科學(xué)研究已經(jīng)證明：Zn2+是超過120種酶的重要組成部分，同時(shí)Zn2+也是所有生物正常細(xì)胞生長、發(fā)育和分化所不可或缺的。文獻(xiàn)表明，Zn2+對(duì)微生物生長及代謝的影響可能有以下幾種途徑和方式：（1）DNA聚合酶[11]和RNA聚合酶[12]都是鋅金屬酶[13]，Zn2+可以決定和穩(wěn)定核苷酸的信息[14-15]，從而通過改變Zn2+的含量即可影響轉(zhuǎn)錄和翻譯。故Zn2+可通過影響DNA聚合酶和RNA聚合酶的合成，來影響蛋白質(zhì)的合成和表達(dá)；（2）在糖酵解過程中，Zn2+是磷酸甘油醛脫氫酶、乙醇脫氫酶和乳酸脫氫酶的活化劑。故Zn2+可參與呼吸作用與多種物質(zhì)代謝過程；（3）Zn2+和氮代謝有密切的關(guān)系。Zn2+含量的多少可以調(diào)控硝酸還原酶的活性強(qiáng)弱[16]，而硝酸還原酶活性的強(qiáng)弱會(huì)影響到氮素的利用和吸收[17]；（4）鹵醇脫鹵酶有3個(gè)重要的催化殘基分別是：Tyr145、Ser132和Arg149[1-2]，Zn2+可以與絲氨酸關(guān)系密切的色氨酸[12]形成配合物并影響其轉(zhuǎn)化過程，故Zn2+還可能通過影響鹵醇脫鹵酶的結(jié)構(gòu)、活性中心等，從而直接影響鹵醇脫鹵酶活力；（5）Zn2+含量的改變使得依賴Zn2+濃度的細(xì)胞內(nèi)某些金屬離子（比如：錳、鐵、銅）濃度的變化[18]，從而介導(dǎo)細(xì)胞膜發(fā)生改變，影響核酸的結(jié)構(gòu)或核酸代謝中涉及的酶活性[19]。

結(jié)合本課題研究結(jié)果推論得知，Zn2+影響重組大腸桿菌生長及鹵醇脫鹵酶合成的途徑可能為（1）、（2）和（4）。Zn2+通過提高重組大腸桿菌E.coli P84A/MC1061的生理活性和生長速率，同時(shí)提高其生物積累量而提高了鹵醇脫鹵酶的表達(dá)量。不但最大酶活的表達(dá)量提高了，而且最大酶活的表達(dá)時(shí)間提前約4 h，此研究不但為重組大腸桿菌表達(dá)鹵醇脫鹵酶的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)工業(yè)規(guī)模鹵醇脫鹵酶的高效生產(chǎn)具有較大的指導(dǎo)作用。

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