孫立旺等

摘要目的：采用低分子肝素（MWH）和聚乙二醇（PEG）對(duì)內(nèi)皮抑素（E）進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾并探討修飾后E的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性尋找一種較好的內(nèi)皮抑素修飾物。方法：采用高碘酸氧化法活化MWH制得的MWH活化液于pH 9.5、.mol/的NaO-NaHO緩沖液中對(duì)內(nèi)皮抑素進(jìn)行化學(xué)修飾氰脲酰氯法活化PEG活化后的PEG在ph 9.、1mmol/的四硼酸鈉緩沖液中進(jìn)行修飾反應(yīng)。D-PAGE電泳監(jiān)測修飾反應(yīng)過程比較不同時(shí)間點(diǎn)修飾液的自由氨基修飾率、活性保留百分率；用ephadex G-5凝膠過濾層析柱進(jìn)行分離純化并進(jìn)行電泳鑒定；觀察內(nèi)皮抑素及修飾后內(nèi)皮抑素在5℃和7℃水浴中的熱穩(wěn)定性；建立雞胚絨毛尿囊膜（AM）模型觀察E及修飾后E對(duì)AM血管生成的抑制作用。結(jié)果：MWH和PEG均能很好的對(duì)E進(jìn)行化學(xué)修飾修飾后E能保持較好的活性和穩(wěn)定性且PEG-E對(duì)新生血管的抑制作用優(yōu)于MWH-E。結(jié)論：PEG是一種較好的內(nèi)皮抑素修飾物。

關(guān)鍵詞內(nèi)皮抑素低分子肝素聚乙二醇結(jié)構(gòu)修飾

材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料：含內(nèi)皮抑素基因的重組表達(dá)載體工程菌山東大學(xué)免疫學(xué)研究所提供；MWH（5 ant-a u/mg）中國煙臺(tái)東誠生化有限公司；PEG-6購自BBI公司；氰尿酰氯（yanuric chiliride）購自igma公司；高碘酸鈉天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心。

PEG和MWH對(duì)E的化學(xué)修飾：采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)按照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行內(nèi)皮抑素蛋白的表達(dá)分離純化后得到電泳單點(diǎn)純的內(nèi)皮抑素。采用氰脲酰氯法活化PEG-6將活化后的PEG-6與內(nèi)皮抑素（以內(nèi)皮抑素蛋白含量計(jì)）按摩爾比：1溶于ph 9.、1mmol/的四硼酸鈉緩沖液中對(duì)E進(jìn)行化學(xué)修飾；采用高碘酸氧化法活化MWH制得的MWH活化液于pH 9.5、mol/的NaO-NaHO緩沖液中對(duì)內(nèi)皮抑素進(jìn)行化學(xué)修飾。通過D-PAGE電泳監(jiān)測修飾反應(yīng)過程比較不同時(shí)間點(diǎn)修飾液的自由氨基修飾率、活性保留百分率。

修飾后E的分離純化：一定反應(yīng)時(shí)間的修飾反應(yīng)液經(jīng)過預(yù)處理后上ephadex G-5柱（16cm×6cm）用PH 8、1mmol/的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行層析分離。

修飾后E對(duì)AM血管生成的作用：將分離純化得到的E及PEG-E、MWH-E用三蒸水分別配制成濃度為5靏/ml溶液。以三蒸水作為空白對(duì)照氫化可的松作為陽性對(duì)照堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bG）作為陰性對(duì)照以上供試液均用5靘的微孔濾膜過濾除菌。將雞胚按重量隨機(jī)分為6組按以下劑量加樣：空白對(duì)照組三蒸水1靗/只；陽性對(duì)照組氫化可的松1靗/只；陰性對(duì)照組bG 靗（8AU）/只；E組為E 1霯l+bG 靗（8AU）/只；PEG-E組為1靗+bG 靗（8AU）/只；MWH-E組為1靗+bG 靗（8AU）/只用微量進(jìn)樣器按上述劑量將供試液直接加到雞胚絨毛尿囊膜上加藥后用無菌透明膠帶封口標(biāo)記后放入溫度7±1℃的培養(yǎng)箱中保持～6的相對(duì)空氣濕度繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)觀察結(jié)果。

結(jié)果

PEG和MWH對(duì)E的化學(xué)修飾：不同修飾反應(yīng)時(shí)間內(nèi)皮抑素的活性變化情況：PEG-E修飾反應(yīng)開始1小時(shí)內(nèi)皮抑素活性變化較大1～小時(shí)變化趨于平緩～8小時(shí)又有較大的變化8～小時(shí)變化較緩此后活性急劇下降。MWH-E修飾反應(yīng)開始1小時(shí)內(nèi)皮抑素活性基本不變；1～小時(shí)變化較大～小時(shí)雖有變化但變化較為平緩；1～小時(shí)維持在一個(gè)平臺(tái)基本不變；～8小時(shí)又有比較大的變化。修飾過程中自由氨基修飾率隨修飾時(shí)間的延長而升高與內(nèi)皮抑素活性的變化相對(duì)應(yīng)。

PEG-E、MWH-E的分離純化：二者經(jīng)ephadex G-5柱層析后均出現(xiàn)兩個(gè)洗脫峰經(jīng)D-PAGE電泳鑒定可知第一峰為修飾后的內(nèi)皮抑素蛋白峰第二峰為未被修飾的內(nèi)皮抑素蛋白峰。對(duì)分離純化后的PEG-E、MWH-E進(jìn)行D-PAGE電泳鑒定結(jié)果顯示純化后的PEG-E、MWH-E在D左右出現(xiàn)一條單一條帶無其他雜帶出現(xiàn)顯示三種修飾物純化理想。

7℃時(shí)內(nèi)皮抑素及其修飾物的分鐘熱穩(wěn)定性大小為PEG-E>MWH-E>E6分鐘后活性保留百分率PEG-E為686MWH-E為59E為991。而5℃時(shí)內(nèi)皮抑素及其修飾物的分鐘熱穩(wěn)定性大小為PEG-E>MWH-E>E保溫6分鐘后活性保留百分率PEG-E為7967MWH-E為76E為6678。

修飾后E對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管生成的作用：在雞胚絨毛尿囊膜血管生長的抑制方面同內(nèi)皮抑素活性相近兩種修飾產(chǎn)物相比以PEG-E效果更佳。

討論

內(nèi)皮抑素作為一種蛋白藥物其半衰期短、生物利用度低等特點(diǎn)限制了它的應(yīng)用。而化學(xué)修飾為蛋白質(zhì)在生物醫(yī)藥和生物技術(shù)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供了一條新穎而有效的途徑。它能夠賦予蛋白質(zhì)和多肽類藥物許多優(yōu)良性能如免疫原性降低或消失不良反應(yīng)減少半衰期延長物理、化學(xué)和生物穩(wěn)定性增強(qiáng)等。PEG類修飾劑是一類大分子聚合物與其他修飾劑相比其毒性小無抗原性具有良好的兩親性且生物相容性已經(jīng)得到DA認(rèn)證特別是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)過PEG類修飾劑修飾后修飾劑的許多優(yōu)良性質(zhì)也會(huì)隨之移植到修飾蛋白中。用肝素類修試劑對(duì)內(nèi)皮抑素進(jìn)行共價(jià)修飾主要是基于肝素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有親和作用而內(nèi)皮抑素又具有肝素的特異性結(jié)合位點(diǎn)同時(shí)肝素本身也有抑制血管生成和抗腫瘤作用肝素對(duì)內(nèi)皮抑素修飾后肝素成為內(nèi)皮抑素和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的橋梁和媒介提高其靶向性并同時(shí)發(fā)揮二者的協(xié)同作用。

本研究以血管生成的經(jīng)典模型-雞胚絨毛尿囊膜模型為評(píng)價(jià)體系觀察E及修飾后E的抑制血管生成作用。研究中發(fā)現(xiàn)純化后的內(nèi)皮抑素能夠明顯的抑制bG誘導(dǎo)下的AM血管生長修飾后E對(duì)AM血管也有較明顯的抑制作用同未修飾的內(nèi)皮抑素效果相近表明修飾后E活性良好在雞胚絨毛尿囊膜血管生長的抑制方面同內(nèi)皮抑素活性相近兩種修飾產(chǎn)物相比以PEG-E效果更佳。

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