馬雅鴿，趙聲蘭，甫琪森，梁寧利

（1.云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.寶雞出入境檢驗(yàn)檢疫局，陜西 寶雞 721006）

地木耳屬于藍(lán)藻門（Cyanophyta），藍(lán)藻綱（Cyanophyceae），念珠藻目（Nostocales），念珠藻科（Nostocaceae），念珠藻屬（Nostoc），是念珠藻中的群體型（Colony），藻絲由50～170個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和異形胞組成[1]。

我國(guó)人民對(duì)地木耳食用廣泛且歷史久遠(yuǎn)，但沒(méi)有引起人們足夠的重視。近年來(lái)，在世界范圍內(nèi)的野生食物開(kāi)發(fā)熱潮中，地木耳的研究和開(kāi)發(fā)才引起人們的重視。研究范圍主要包括：分類和描述、生態(tài)學(xué)、營(yíng)養(yǎng)成分、生理生化、生物活性物質(zhì)、分子生物學(xué)、人工培養(yǎng)、產(chǎn)品開(kāi)發(fā)等[2-3]。在地木耳產(chǎn)品開(kāi)發(fā)方面的研究，主要集中在蛋白飲料的研究，而對(duì)地木耳發(fā)酵產(chǎn)品的研究還少見(jiàn)報(bào)道，實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助水提制備地木耳提取物后，進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵的研究，為地木耳產(chǎn)品的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地木耳（Nostoc communeVauch.）分別采自云南昆明松花壩水庫(kù)及云南曲靖市富源縣；原料乳為市售歐亞全脂滅菌乳；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）47和嗜熱乳鏈球菌（Streptococcus thermophilus）38均購(gòu)買自云南省微生物研究所；水（符合GB5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中要求；蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、吐溫-80、K2HPO4·7H2O，乙酸鈉，檸檬酸三銨，MgSO4·7H2O，MnSO4·4H2O，瓊脂粉等均為市售。

甲苯胺藍(lán)染液：稱取0.2g甲苯胺藍(lán)，用少量丙酮溶解后以蒸餾水定容至100mL。MRS 培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉8.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐溫-80 1.0g/L，K2HPO42.0g/L，檸檬酸氫二銨2.0g/L，乙酸鈉5.0g/L，MgSO40.2g/L，MnSO40.04g/L，pH值6.2。

1.2 儀器與設(shè)備

GHP-9080隔水恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；NikonYS100生物顯微鏡：日本尼康公司；YXQ-LSSOS2高壓滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PHS-3C型pH計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；DHG-9240A型干燥箱：上海一恒科技有限公司；SK7210HP超聲清洗儀：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；雙人單面超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；UX6200H分析天平：北京賽多利斯儀器系列有限公司。

1.3 方法

1.3.1 地木耳水提物的制備

將地木耳與石英砂按1∶2的比例混勻，研磨15min，然后精確稱取地木耳粉5g，置于500mL錐形瓶中，加入250mL蒸餾水，浸泡30min，90℃超聲破碎15min后，煎煮（武火煮沸，文火保持30min），濾布過(guò)濾，濾渣加水（地木耳/水=1∶10，時(shí)間30min）煎煮，過(guò)濾，濾液合并，4℃以12000×g的離心力離心15min，取上清液，制得地木耳水提物，密封至冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 乳酸菌菌種的活化

取保藏保加利亞乳桿菌和嗜熱乳鏈球菌菌種分別按4%接種量接種于脫脂乳中，41℃～42℃培養(yǎng)，凝乳時(shí)取出，制片觀察菌體形態(tài)，保證菌體形態(tài)正常并且無(wú)雜菌，用此次活化菌種接種、培養(yǎng)，單菌種各活化1次，然后將兩菌種按1∶1的比例接種于脫脂乳中，總接種量為3%，然后培養(yǎng)，反復(fù)活化幾次至菌體活力穩(wěn)定后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 地木耳酸奶加工工藝流程

操作要點(diǎn)：量取100mL純奶，原料乳的酸度0.09%乳酸，固形物含量8.1%，脂肪含量3.5%，蛋白質(zhì)含量3.0%，接種10%保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱乳鏈球菌（Streptococcus thermophilus）混合發(fā)酵液，溫度41℃～42℃培養(yǎng)。3h后開(kāi)始觀察凝乳情況，記錄凝乳時(shí)間，完全凝乳后，測(cè)其酸度和乳酸菌菌數(shù)，并對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)定，再4℃冷卻，后熟發(fā)酵24h，取出測(cè)定其酸度和乳酸菌菌數(shù)，并對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)定。

1.3.4 地木耳提取物添加量對(duì)酸乳品質(zhì)的影響

將地木耳水提物按0%、5%、10%、15%、20%、25%不同的添加量分別加入100mL凝乳之后的酸乳中，再放入4℃冰箱后熟發(fā)酵24h，取出測(cè)其酸度和乳酸菌菌數(shù)，并對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)定，探討地木耳添加量對(duì)酸乳品質(zhì)影響。

1.3.5 地木耳提取物添加量對(duì)牛乳發(fā)酵的影響

將地木耳水提物按0%、5%、10%、15%、20%、25%不同添加量加入滅菌后的鮮乳中，發(fā)酵之后4h后開(kāi)始觀察凝乳情況，完全凝乳后，取出測(cè)定其酸度和乳酸菌菌數(shù)，并對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)定，再放入4℃冰箱后熟發(fā)酵24h，取出測(cè)定其酸度和乳酸菌菌數(shù)，并對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)定，探討地木耳添加量對(duì)牛乳發(fā)酵的影響。

1.3.6 酸度檢測(cè)方法

取成品酸奶1mL用蒸餾水稀釋10倍，并搖勻，滴加兩滴酚酞試劑，用0.09523mol/L NaOH溶液滴定，當(dāng)溶液由無(wú)色變?yōu)榉奂t色且30s不褪去即為滴定終點(diǎn)，記錄消耗NaOH體積，樣品的滴定酸度由如下公式計(jì)算：

式中：C 為標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的濃度，mol/L；V 為滴定消耗氫氧化鈉溶液體積，mL；m 為樣品質(zhì)量或體積，g 或mL；0.1 為理論氫氧化鈉的摩爾濃度，mol/L；100 為稀釋倍數(shù)。

1.3.7 乳酸菌計(jì)數(shù)方法

（1）甲苯胺藍(lán)特殊染色法[4-5]

在自制計(jì)數(shù)板滴加0.01mL樣品稀釋液，用接種針小心涂滿1cm2的方孔使其均勻。晾干后在酒精燈上加熱固定數(shù)秒。滴加0.2%的甲苯胺藍(lán)染色液于上述樣品上，在酒精燈上稍加熱后移開(kāi)，在室溫下染色2min后水洗晾干。然后用1%的乙酸進(jìn)行脫色1s～2s即用水沖洗去乙酸，用濾紙吸干液體后鏡檢（鏡檢時(shí)選用油鏡，選取30個(gè)視野），乳酸菌數(shù)按下式計(jì)算：

乳酸菌總數(shù)（CFU/mL）=每個(gè)視野中的乳酸菌平均數(shù)×106×樣液稀釋倍數(shù)

（2）平板涂布計(jì)數(shù)法（國(guó)標(biāo)法）[6]

根據(jù)GB4789.35-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》，選擇2 個(gè)適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取0.1mL 樣品于2 個(gè)MRS培養(yǎng)基平板，用L形涂布棒將菌液涂布均勻，培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)。平板上菌落數(shù)以無(wú)蔓延菌落，每皿菌落數(shù)在30CFU～300CFU之間為宜。若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）中菌落總數(shù)結(jié)果。若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按下列公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：N 為樣品中菌落數(shù)，CFU/mL；ΣC 為平板菌落數(shù)之和；n1 為第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；n2 為第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；d 為稀釋因子。

1.3.8 酸奶感官評(píng)定方法

對(duì)酸奶從顏色、體態(tài)、氣味和滋味4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)定，滿分為10分，6位評(píng)判員對(duì)其進(jìn)行品評(píng)打分，取平均分。酸奶感官評(píng)分（滿分10分）標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

1.3.9 地木耳酸奶理化及微生物指標(biāo)測(cè)定方法

表1 酸奶感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of yoghourt

測(cè)定物標(biāo)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)1HAIS2shen產(chǎn)品的理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)按照GB19302-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》中標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 地木耳提取物添加量對(duì)酸乳品質(zhì)的影響

酸乳凝乳后加入不同添加量地木耳提取物，對(duì)酸乳品質(zhì)影響結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 地木耳添加量對(duì)酸乳品質(zhì)影響Table 2 Effects ofNostoc commune addition on the quality of yoghurt

從表2可知，凝乳后，添加地木耳水提物樣品在酸度和菌數(shù)方面均比對(duì)照要高，由此可見(jiàn)地木耳提取物對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。而且都隨添加量的增加而增加，之后再減少，添加地木耳提取物5%、10%樣品的酸度和菌數(shù)均比對(duì)照高出許多，可能地木耳富含多糖，其中多糖促進(jìn)了乳酸菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)了發(fā)酵過(guò)程，縮短了發(fā)酵；添加地木耳提取物15%、20%、25%樣品酸度和菌數(shù)依次減少，可能是添加地木耳提取物體積過(guò)大，反而對(duì)培養(yǎng)體系進(jìn)行了稀釋的緣故。

從乳酸菌數(shù)測(cè)定結(jié)果來(lái)看，甲苯胺藍(lán)染色法的數(shù)值總是高于國(guó)標(biāo)法，主要由于國(guó)標(biāo)法測(cè)定的是活菌數(shù)，而甲苯胺藍(lán)染色法測(cè)定的是總菌數(shù)。

從感官評(píng)分看，地木耳提取物添加量5%的酸乳風(fēng)味最好，10%、15%次之，20%、25%最差，總體而言，酸乳風(fēng)味的好壞與酸度的高低有很大關(guān)系，酸度達(dá)到一定值，酸度越高風(fēng)味越差，沒(méi)達(dá)到最佳值，隨著酸度增加，風(fēng)味越來(lái)越好。

2.2 地木耳提取物添加量對(duì)牛乳發(fā)酵的影響

在鮮乳中加入不同添加量的地木耳提取物，進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵，不同發(fā)酵時(shí)間地木耳添加量對(duì)牛乳發(fā)酵的影響結(jié)果分別見(jiàn)表3、表4。

表3 地木耳添加量對(duì)牛乳發(fā)酵的影響(4h)Table 3 Effects ofNostoc commune addition on the fermentation of milk (4h)

表4 地木耳添加量對(duì)牛乳發(fā)酵的影響(24h)Table 4 Effects ofNostoc commune addition on the fermentation of milk (24h)

由表3可知，加入地木耳水提物和牛乳、乳酸菌同時(shí)發(fā)酵，凝乳時(shí)間縮短，發(fā)酵4h后，酸度和乳酸菌的活菌都得到了很大提高。證明適當(dāng)添加量的地木耳水提物對(duì)乳酸菌的繁殖也有明顯的促進(jìn)作用。

由表4可知，加入地木耳水提物和牛乳、乳酸菌同時(shí)發(fā)酵，后熟24h樣品在酸度、菌數(shù)、感官評(píng)定方面的規(guī)律性同酸乳凝乳后加入地木耳與乳酸菌的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

總之，對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖的影響方面，在接菌種時(shí)加地木耳水提物比凝乳后再加地木耳水提物，發(fā)酵酸度、菌數(shù)增加快一些，可能是在接菌種時(shí)加地木耳水提物，地木耳提供了乳酸菌生長(zhǎng)繁殖所需的合適營(yíng)養(yǎng)，加速了乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖；對(duì)產(chǎn)品顏色的影響方面，凝乳后再添加地木耳水提物，產(chǎn)品呈明顯的淺褐色，而且隨著水提物添加量的增加，顏色越深，說(shuō)明地木耳提取物里面的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)沒(méi)有被乳酸菌充分利用，而在接菌種時(shí)加地木耳水提物的所有樣品，顏色都同對(duì)照一樣呈均勻天然的乳白色；對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味的影響方面，接菌種時(shí)加地木耳水提物比凝乳后再加地木耳水提物，產(chǎn)品的風(fēng)味更獨(dú)特，產(chǎn)品還會(huì)呈現(xiàn)出特殊香味。因此，在接菌種時(shí)加地木耳水提物可縮短酸奶的發(fā)酵時(shí)間，節(jié)約成本，產(chǎn)品呈均一的乳白色，風(fēng)味獨(dú)特，香氣宜人。

2.3 地木耳酸奶品質(zhì)分析

地木耳酸奶產(chǎn)品的理化指標(biāo)見(jiàn)表5、表6。

表5 地木耳酸奶的理化指標(biāo)Table 5 Physical and chemical indexes ofNostoc commune-yogurt

表6 地木耳酸奶的微生物指標(biāo)Table 6 Microbial indexes ofNostoc commune-yogurt

由表5、表6可知，地木耳酸奶產(chǎn)品質(zhì)量符合國(guó)標(biāo)GB19302—2010《發(fā)酵乳》中風(fēng)味乳指標(biāo)要求。

3 結(jié)論

地木耳水提物對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖有很大的促進(jìn)作用，能縮短酸奶的后熟時(shí)間，而且能夠產(chǎn)生特殊的香味物質(zhì)，對(duì)酸奶的感官顏色沒(méi)有產(chǎn)生不良影響。因此地木耳酸奶生產(chǎn)的最佳條件是：在原料乳中，加地木耳水提物10%，乳酸菌接種量10%，40℃發(fā)酵4h，后熟12h。

[1]趙惠玲，王 青，李 砧.地木耳分子生物學(xué)特性初步探究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊，2010（9）：16-19.

[2]李敦海，劉永定.近十年中國(guó)地木耳研究概況[J].水生生物學(xué)報(bào)，2003（2）：408-412.

[3]鄧中洋.葛仙米、地木耳的大量培養(yǎng)及葛仙米形態(tài)生理特征研究[D].武漢：中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所博士論文，2006.

[4]厲榮玉，錢森和，董 群，等.地木耳總黃酮提取及抑菌作用[J].皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，3（3）：186-190.

[5]胡良成，宋光泉，陳清泉，等.地木耳營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的初步研究[J].常德高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，1995（5）：44-46.

[6]張?zhí)苽ィ瑮?樂(lè)，柳青海，等.地木耳多糖的抗氧化性與抑菌作用[J].食品與生物技術(shù)學(xué)，2011（11）：868-873.

[7]胡良成，宋光良，陳清泉，等.地木耳營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的初步研究[J].常德高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)，1995（5）：44-46.

[8]任大勇，曹 婧，章檢明，等.6 種乳酸菌計(jì)數(shù)方法的比較研究[J].糧油加工，2012（9）：108-110.

[9]俞，漪，胡雪蓮.酸乳中乳酸菌計(jì)數(shù)方法改進(jìn)和研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2012（9）：118-120.

[10]辛若竹，劉洋來(lái)，魏昆民.活性酸乳中乳酸菌的直接鏡檢計(jì)數(shù)法[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007（3）：476-477.

[11]方改霞，單林娜，李 慧，等.多菌種酸奶中活性乳酸菌的計(jì)數(shù)方法研究[J].微生物學(xué)雜志，2009（3）：101-104.

[12]GB16321-2003《乳酸菌飲料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

[13]GB19302-2010《發(fā)酵乳》[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[14]GB5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.

[15]陳 博，耿麗晶，周 圍.藍(lán)莓大豆酸奶工藝條件的研制[J].遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010（4）：350-352.