魏 濤，王麗娟，毛多斌，陶 靜，劉蘇萌，馬歌麗，何培新

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

一些微生物在一定條件下利用碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭忍荚丛诰w內(nèi)合成并積累油脂，油脂含量超過總生物量的20%，即稱為產(chǎn)油微生物。產(chǎn)油微生物所產(chǎn)生積累的油脂稱為微生物油脂[1-3]。目前已報(bào)道霉菌、酵母菌、細(xì)菌以及藻類的某些菌株都可以產(chǎn)生大量油脂，但以斯達(dá)油脂酵母菌（Lipomyces starkeyi）、粘紅酵母屬（Rhodotorula glutinis）、曲霉屬（Aspergillus）以及毛霉屬（Mucor）等真核微生物常見[4]。隨著化石能源的短缺，石油價(jià)格的不斷攀升，尋找新的可再生資源成為當(dāng)今世界各國(guó)的一個(gè)重要議題。通過生物化工和微生物發(fā)酵制取能源產(chǎn)品與化學(xué)品，部分替代化石資源，將是多渠道開發(fā)可再生資源的必然趨勢(shì)。利用微生物生產(chǎn)油脂在開發(fā)新油脂資源方面具有良好的發(fā)展前景，因此探索研究微生物積累油脂具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[5-6]。

利用微生物生產(chǎn)油脂具有不受季節(jié)和氣候的影響、生產(chǎn)原料來源廣泛、油脂含量高、質(zhì)量穩(wěn)定、可連續(xù)進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)和生產(chǎn)周期短等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。本研究以粘紅酵母菌H810為出發(fā)菌株，通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化粘紅酵母菌H810產(chǎn)油脂培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件，分析了在優(yōu)化條件下油脂成分，旨在提高粘紅酵母菌H810生物量和油脂產(chǎn)量，為其進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

粘紅酵母菌H810，本實(shí)驗(yàn)室選育菌種。葡萄糖、酵母膏和蛋白胨均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；所用化學(xué)試劑乙醚、甲醇等購自天津市德恩化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

種子斜面保藏酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract pep tone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，瓊脂20g/L，自然pH；

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，酵母粉0.5g/L，硫酸銨5g/L，磷酸二氫鉀1g/L，七水合硫酸鎂0.5g/L，自然pH；

搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖70g/L，硫酸銨1g/L，酵母膏0.5g/L，磷酸二氫鉀1g/L，七水合硫酸鎂1g/L，自然pH。

以上培養(yǎng)基均在121℃飽和蒸汽下滅菌15min。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-Y電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海左科儀器設(shè)備有限公司；SHB-3循環(huán)水多用真空泵：鄭州杜甫儀器廠；SCT-06索氏提取儀：上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；LA-230S型電子天平：北京賽多利斯有限公司；GC6890氣相色譜：美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 粘紅酵母的培養(yǎng)

培養(yǎng)斜面上將一環(huán)活化菌體接于80mL液體種子培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)20h～28h。以10%接種量接種于80mL發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)96h。

1.3.2 油脂提取與測(cè)定

粘紅酵母生物量測(cè)定：將培養(yǎng)好的菌體8000r/min離心15min，去除上清液，得到濕菌體，110℃烘干至質(zhì)量恒定，自然冷卻至室溫后稱質(zhì)量，即為菌體干質(zhì)量，以g干菌體/L發(fā)酵液表示菌體生物量。

菌體油脂的含量測(cè)定：參照索氏抽提法直接進(jìn)行油脂抽提[9-10]。菌體烘干，研磨粉碎后取一定質(zhì)量的干菌體粉末用濾紙包好，放入索氏抽提器的提取管中，以60℃～90℃沸程的石油醚為抽提劑，水浴提取6h～8h，取下抽提瓶，在93℃水浴中揮發(fā)掉殘留石油醚，再于95℃～105℃烘干2h，準(zhǔn)確稱量粗油脂質(zhì)量。油脂含量按下式計(jì)算：

式中：X 為樣品中油脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；m為樣品的質(zhì)量，g；m0為油脂抽提瓶的質(zhì)量，g；m1為油脂及油脂抽提瓶的質(zhì)量，g。

油脂脂肪酸組分分析：采用氣相色譜法分析油脂脂肪酸組分。氣相色譜（GC）條件[11-12]：GC6890氣相色譜儀進(jìn)行分析，氮?dú)鉃檩d氣，毛細(xì)管色譜柱HP-5MS（30m×0.25mm×0.2μm），柱溫初溫200℃，程序升溫，以5℃/min速度升至220℃，保溫30min，進(jìn)樣口溫度240℃，分流比1∶25，進(jìn)樣體積2μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源的選擇

碳源是微生物生長(zhǎng)繁殖最重要的營(yíng)養(yǎng)成分，而粘紅酵母H810對(duì)不同碳源的利用能力和速度是不同的，本研究考察了在葡萄糖、木糖、淀粉、蔗糖、阿拉伯糖、乳糖和麥芽糖在不同碳源下（碳源添加量5%），粘紅酵母H810菌體生物量和細(xì)胞油脂含量的變化情況，結(jié)果見圖1。

圖1 不同碳源對(duì)粘紅酵母H810菌體生物量和油脂合成的影響Fig.1 Effect of carbon sources on biomass and lipid content ofRhodotorula glutinis H810

由圖1可知，粘紅酵母H810利用碳源的能力為葡萄糖＞木糖＞阿拉伯糖＞蔗糖＞淀粉＞乳糖＞麥芽糖。葡萄糖是菌體細(xì)胞生長(zhǎng)的最佳碳源，也是菌體油脂合成的最適碳源，添加5%葡萄糖，其培養(yǎng)液生物量達(dá)到34g/L，菌體油脂含量達(dá)到49%。

2.2 氮源的選擇

適宜種類和濃度的氮源不僅能促進(jìn)粘紅酵母菌H810高效利用葡萄糖、木糖等碳源，而且可以減少次級(jí)代謝產(chǎn)物的形成。由圖2可知，不同氮源（氮源添加量5%）對(duì)粘紅酵母H810生長(zhǎng)影響較大。

圖2 不同氮源對(duì)粘紅酵母H810菌體生物量和油脂合成的影響Fig.2 Effect of nitrogen sources on biomass and lipid content ofRhodotorula glutinis H810

由圖2可知，粘紅酵母H810利用氮源的能力為酵母膏＞磷酸二氫銨＞硫酸銨＞蛋白胨＞硝酸銨＞尿素。酵母膏是粘紅酵母H810菌體細(xì)胞生長(zhǎng)和合成油脂的最適氮源，添加5%酵母膏，其培養(yǎng)液生物量達(dá)到32g/L，菌體油脂含量達(dá)到47%。

2.3 碳氮比（C/N）的選擇

微生物細(xì)胞生長(zhǎng)需要充分的氮源，而油脂的合成一般在氮源耗盡而碳源豐富的條件下，C/N的高低對(duì)菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)和油脂的合成影響較大[13]。實(shí)驗(yàn)選擇葡萄糖為碳源，酵母膏為氮源，考察不同的C/N對(duì)菌體生物量和油脂含量的影響。由表1可知，C/N為40時(shí)，粘紅酵母H810的菌體生物量和油脂含量為最高，過高和過低的比例都不適合酵母菌體生長(zhǎng)和油脂產(chǎn)生。

表1 C/N對(duì)粘紅酵母H810菌體生物量和油脂合成的影響Table 1 Effect of C/N on biomass and lipid content ofRhodotorula glutinis H810

2.4 培養(yǎng)溫度

培養(yǎng)溫度是影響粘紅酵母H810油脂合成的一個(gè)重要條件。由圖3可知，在28℃時(shí)，粘紅酵母H810產(chǎn)油脂率最高，溫度過高或過低油脂產(chǎn)量均明顯下降。培養(yǎng)溫度28℃作為粘紅酵母H810的最佳產(chǎn)脂溫度。

圖3 不同溫度對(duì)粘紅酵母H810菌體生物量和油脂合成的影響Fig.3 Effect of culture temperatures on biomass and lipid content ofRhodotorula glutinis H810

2.5 培養(yǎng)基初始pH值

發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值是影響粘紅酵母H810菌體生長(zhǎng)和油脂產(chǎn)量的一個(gè)重要條件，合適的pH值可以促進(jìn)產(chǎn)油酵母的生物量和油脂合成[14-15]。由圖4可知，在初始pH值高于或低于6.8時(shí)，粘紅酵母H810生物量和油脂產(chǎn)量均明顯下降，所以6.8是粘紅酵母H810的最佳生長(zhǎng)和產(chǎn)脂pH值。

圖4 不同pH值對(duì)粘紅酵母H810菌體生物量和油脂合成的影響Fig.4 Effect of pH value on biomass and lipid content ofRhodotorula glutinis H810

2.6 接種量

接種量是影響微生物油脂產(chǎn)量的重要因素，接種量不同，菌體生物量和油脂產(chǎn)量也不同。接種量過大，菌體生長(zhǎng)期細(xì)胞數(shù)量過多，單細(xì)胞油脂產(chǎn)量反而下降，細(xì)胞內(nèi)積存的油脂過多，又會(huì)使菌體失去增殖能力，因此應(yīng)使微生物細(xì)胞處于一定數(shù)量，以保持菌體的增殖能力和產(chǎn)油生理狀態(tài)。由圖5可知，粘紅酵母H810的接種量為6%時(shí)，菌體生物量和油脂含量為最高，接種量過大，油脂合成減少。

圖5 不同接種量對(duì)粘紅酵母H810菌體生物量和油脂合成的影響Fig.5 Effect of inoculumu on biomass and lipid content ofRhodotorula glutinis H810

2.7 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以油脂含量為考察指標(biāo)，選擇碳氮比C/N、溫度、pH值和接種量4個(gè)主要影響因素作4因素3水平L9（34）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)粘紅酵母H810產(chǎn)油脂最佳發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化篩選[8]，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 粘紅酵母H810發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation condition ofRhodotorula glutinis H810

表3 粘紅酵母H810產(chǎn)油脂最佳發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment of lipid content ofRhodotorula glutinis H810

從表2極差結(jié)果得出，影響粘紅酵母H810油脂含量的因素大小為RA＞RD＞RB＞RC，即碳氮比C/N＞接種量＞溫度＞pH。表3方差分析結(jié)果表明，碳氮比C/N和培養(yǎng)溫度對(duì)油脂含量影響極顯著；接種量對(duì)油脂含量影響顯著，培養(yǎng)基初始pH對(duì)油脂含量影響不顯著。最佳提取條件為A2B2C2D1，即碳氮比C/N為40，接種量為5%，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)初始pH值為6.8。在此最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，粘紅酵母H810油脂含量為56.88%。

2.8 油脂組分分析

菌株H810在優(yōu)化培養(yǎng)條件下油脂組分分析見表4，油脂中以油酸47.95%為主，其次為亞油酸12.96%、棕櫚酸12.34%、α-亞麻酸11.76%和γ-亞麻酸7.30%，多不飽和脂肪酸總含量92%以上，在醫(yī)藥保健行業(yè)具有重要工業(yè)應(yīng)用前景。

表4 菌株H810所產(chǎn)油脂組分分析Table 4 Analysis of lipid content produced byRhodotorula glutinis H810

3 結(jié)論

本研究在以碳氮比C/N、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)pH和接種量各單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)得出了粘紅酵母H810產(chǎn)油脂最佳發(fā)酵條件，即碳氮比C/N為40，接種量為5%，培養(yǎng)溫度為28℃和培養(yǎng)pH值為6.8，在此條件下粘紅酵母H810油脂含量達(dá)到56.88%，比文獻(xiàn)報(bào)道高出10%左右[7]。在該條件下粘紅酵母H810油脂成分主要包括油酸47.95%、亞油酸12.96%、棕櫚酸12.34%、α-亞麻酸11.76%和γ-亞麻酸7.30%。采用該工藝發(fā)酵粘紅酵母H810生產(chǎn)微生物油脂具有一定的應(yīng)用價(jià)值，也為大規(guī)模生產(chǎn)微生物油脂和研究油脂的不飽和性能提供了研究基礎(chǔ)。

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