呂和鑫，賈士儒*，肖玉朋，袁南南，戴玉杰

（天津科技大學(xué) 天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457）

發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌（Nostoc flagelliforme）即俗稱的發(fā)菜，是一種陸生固氮藍(lán)藻，主要分布于干燥多風(fēng)、雨量稀少的地區(qū)，年降水量為167.3mm～447.4mm，平均為261.2mm，極端最低降水量47.9mm[1]。發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌在我國主要分布于西北干旱地區(qū)，如內(nèi)蒙古、甘肅及青海等地。發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌在我國作為一種食品與節(jié)日禮物已有很久的歷史。尤其是我國廣東等南方省份，因發(fā)菜具有“發(fā)財”的諧音，受到很多人的喜愛。發(fā)菜的食用歷史在我國已經(jīng)有上千年，傳說漢代發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌便已經(jīng)作為宮廷貢品[2]。發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌在野生環(huán)境中生長非常緩慢，據(jù)觀察，其年增長率僅為6%左右[3]。對發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌的過度采伐對西北干旱地區(qū)的環(huán)境造成了草地退化等嚴(yán)重破壞。我國政府在2000年下發(fā)通知，禁止發(fā)菜的采掘與銷售等活動。因此，研究發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌的人工培養(yǎng)對于環(huán)境保護(hù)與滿足消費市場均具有重要意義。

相比固體培養(yǎng)，液體培養(yǎng)具有生長速度快、空間占用小、培養(yǎng)密度高、培養(yǎng)條件較易控制等優(yōu)勢。前期研究表明，利用BG11m液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時添加15mmol/L的碳酸氫鈉可以促進(jìn)發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌的生長、胞外多糖的積累、光合效率的提高[4]。硝酸鈉為微生物與植物等培養(yǎng)中常用的氮源。本研究觀察了在添加15mmol/L碳酸氫鈉時不同硝酸鈉濃度對發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌生長、胞外多糖含量以及光合速率的促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌分離細(xì)胞由天津科技大學(xué)天津市工業(yè)微生物重點實驗室保存。采用添加15mmol/L NaHCO3的修改過的BG11m培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加0、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L的硝酸鈉以制成不同質(zhì)量濃度梯度NaNO3的BG11m培養(yǎng)基。

濃硫酸（天津市文達(dá)稀貴試劑化工廠），苯酚（天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心），無水乙醇（天津市四通化工廠），無水葡萄糖（天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心），氯化鈉（天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠），鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀（天津化學(xué)試劑三廠）；所用藥品均為AR級。

1.2 儀器與設(shè)備

液相氧電極：英國Hansatech公司；PHSJ-4A pH計：上海雷磁儀器廠；722型分光光度計：北京光學(xué)儀器廠；LD5-2A臺式高速離心機：上海醫(yī)用分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

利用500mL玻璃搖瓶，加入200mL有梯度濃度NaNO3的BG11m培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)，光照強度為60μmol/（m2·s），培養(yǎng)溫度為25℃。連續(xù)培養(yǎng)15d后取樣測定各生理指標(biāo)。

1.3.2 生理指標(biāo)測定方法

干重法生物量分析：100mL發(fā)酵液，4000r/min離心10min收集藻體，80℃烘至質(zhì)量恒定。

葉綠素含量測定采用甲醇提取法[5]。

胞外多糖（exopoly saceharides，EPS）測定：采用苯酚-硫酸法[6]。

光合作用放氧速率測定：采用液相氧電極（Oxylab，Hansatech公司）測定溶解氧變化[7]。

藻體蛋白質(zhì)含量測定：按照GB 5009.5—2010[8]《食品中蛋白質(zhì)測定》的方法。將0.25g藻體、0.2g CuSO4、6gK2SO4、20mL濃硫酸混合均勻，300℃加熱30min，之后400℃加熱直至溶液變成透明淺藍(lán)色為止；冷卻后用0.1mol/L的HCl進(jìn)行滴定。

陰離子濃度測定：磷酸根測定采用鉬藍(lán)比色法，GB11893—1989《水質(zhì)總磷測定》[9]；硝酸根測定采用水楊酸-濃硫酸法[10]，用濃硫酸配制5%（w/v）的水楊酸試劑，分別吸取0～1.0g/L的硝酸鈉溶液0.1mL于試管中，加入0.4mL水楊酸試劑，室溫放置20min，然后加入9.5mL 2mol/L的NaOH溶液，冷卻至室溫后，于波長410nm處測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用濃硫酸代替水楊酸試劑，作為空白，以消除濃硫酸和樣品中物質(zhì)反應(yīng)而帶來的影響。取適當(dāng)稀釋的樣品，同法操作，測定硝酸根含量。

1.4 數(shù)據(jù)分布方法

采用Origin 7.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，采用SPSS軟件的Post Hoc Test進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度NaNO3對發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌生物量的影響

由圖1可知，在補加15mmol/L的NaCO3情況下，補加一定質(zhì)量濃度的NaNO3可以促進(jìn)發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌的生長。隨著NaNO3質(zhì)量濃度增加，對細(xì)胞生物量的積累具有明顯促進(jìn)作用，在添加質(zhì)量濃度為2.0g/L時，細(xì)胞生物量為0.83g/L，相比沒有加NaNO3的空白對照生物量提高了43%。隨后NaNO3添加質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加，細(xì)胞生物量不再增加，達(dá)到平衡（p＞0.05）。因此，從對細(xì)胞的生長速率以及生產(chǎn)成本來說，添加質(zhì)量濃度為2.0g/L時，最適合發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞的生長；在BG11m作為培養(yǎng)基時，NaNO3質(zhì)量濃度超過2.0g/L之后，氮源不再是生長的限制性營養(yǎng)因素。

2.2 不同濃度NaNO3對發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌生理活動的影響

圖1 不同的NaNO3濃度對細(xì)胞生物量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of NaNO3 on the biomass ofN.flagelliforme

表1為不同濃度NaNO3培養(yǎng)15d后的光合與呼吸作用、胞外多糖（EPS）、蛋白質(zhì)以及硝酸根與磷酸根的消耗量的結(jié)果。通過表1可以看出，細(xì)胞呼吸作用在NaNO3質(zhì)量濃度為2.5g/L時達(dá)到最大，而凈光合作用在2.0g/L時較高。葉綠素隨著NaNO3質(zhì)量濃度的增加而增加，在3.0g/L時達(dá)到30.64mg/g；胞外多糖在NaNO3質(zhì)量濃度為0時，為50.95mg/L，達(dá)到這些濃度中的最大值，表明氮源濃度的提高不利于胞外多糖的積累，此結(jié)果與于海峰[11]研究的結(jié)果是一致。細(xì)胞中蛋白質(zhì)的含量隨著NaNO3質(zhì)量濃度的增加而增加。在3.0 g/L時，達(dá)到最大值，說明在碳源提供充足的條件下，外加充足的氮源可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的合成。細(xì)胞消耗的營養(yǎng)鹽隨著NaNO3質(zhì)量濃度的增加而增加，這與細(xì)胞生物量、細(xì)胞內(nèi)外分泌物以及藻類生成其他物質(zhì)相關(guān)。硝酸根的消耗隨著NaNO3質(zhì)量濃度的升高逐漸升高，這與細(xì)胞生物量與細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的增加相一致。磷酸鹽的消耗雖然在NaNO3質(zhì)量濃度為2.0g/L與2.5g/L時濃度變小，但是在NaNO3質(zhì)量濃度達(dá)到3.0g/L時磷酸根消耗出現(xiàn)明顯增加，在NaNO3質(zhì)量濃度為2.0g/L與2.5g/L時磷酸根消耗出現(xiàn)的下降的原因可能為分析方法的精確度不夠。

2.3 對發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞生長pH值的影響

添加NaHCO3濃度為15mmol/L，NaNO3的質(zhì)量濃度分別為1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L，在500 mL三角瓶中培養(yǎng)15d后，使用pH計測定培養(yǎng)液pH值。

由圖2可知，當(dāng)NaHCO3濃度一定，NaNO3的質(zhì)量濃度分別為1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0g/L時，培養(yǎng)液的pH值之間相差不大，為8.67～8.76。由圖2可知，在添加NaNO3的濃度為0g/L時，細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束時pH值達(dá)到了9.32，明顯高于添加NaNO3實驗組，說明NaNO3在提供氮源的同時，對發(fā)酵液的pH值有明顯的緩沖作用。

表1 不同的NaNO3濃度對細(xì)胞光合、胞內(nèi)外產(chǎn)物以及消耗物質(zhì)的影響Table 1 Effects of NaNO3 on photosynthesis,production and consumption ofN.flagelliforme

圖2 NaNO3濃度對發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞生長pH值的影響Fig.2 Effects of different concentrations of NaNO3 on pH value ofN.flagelliforme borth

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，在添加15mmol/L的NaHCO3時添加無機氮源NaNO3可以促進(jìn)發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌的生長。通過測定不同質(zhì)量濃度NaNO3下的生物量，表明隨著添加NaNO3質(zhì)量濃度的增加，生物量的積累逐漸增加，在NaNO3質(zhì)量濃度為2.0g/L時，對細(xì)胞生長的促進(jìn)作用最大，藻細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)到最大值，相對應(yīng)，凈光合速率也達(dá)到最大值。隨著添加濃度的繼續(xù)增加，細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)到平衡。細(xì)胞呼吸作用在NaNO3含量為2.5g/L時最大。細(xì)胞蛋白質(zhì)含量隨NaNO3質(zhì)量濃度的增大逐漸升高，細(xì)胞對NO3-與PO43-的利用率也逐漸增高。在不同NaNO3濃度下，培養(yǎng)15d后的培養(yǎng)液的pH值差異不顯著，但是添加組的最終pH值明顯比不加硝酸鈉的空白對照要小，可見無機氮源對于培養(yǎng)液的pH值具有一定的穩(wěn)定與緩沖作用。

發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌是一種固氮藍(lán)細(xì)菌，可以利用光合作用捕獲的光能進(jìn)行固氮作用[12]。外加無機氮源可以促進(jìn)微藻的生長在許多藻種中已經(jīng)有許多的報道。可能的機制為兩方面：第一是降低了藻細(xì)胞用于固氮的能量，將更多的光合作用捕獲的光能用于其他的代謝途徑中；第二是為蛋白質(zhì)合成與其他需要氮元素的代謝途徑提供了充足的氮源進(jìn)而促進(jìn)了整個細(xì)胞的生長。硝酸鹽是微藻中常用的氮源，硝酸根依次在硝酸根還原酶以及亞硝酸還原酶的作用下最終還原為銨根，進(jìn)一步用于氨基酸的合成等代謝途徑。

研究表明，添加一定質(zhì)量濃度的NaNO3可以促進(jìn)發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌的生長，在硝酸根含量達(dá)到2g/L后細(xì)胞的生物量不再增加，但是光合色素葉綠素的含量進(jìn)一步增加，但是總光合速率與凈光合速率在2.0g/L達(dá)到最大然后降低。另一方面，呼吸速率隨著NaNO3質(zhì)量濃度的增加，呼吸速率逐漸增加。對這個現(xiàn)象一個可能的解釋是隨著硝酸根的提高，光合能力被逐漸抑制，但是較多氮源的存在需要更多地還原力如還原型輔酶Ⅰ（NADH)、還原型輔酶Ⅱ（NADPH）用于硝酸根的還原，因此更多地葉綠素a（光合中心色素）捕獲的光能用于進(jìn)行環(huán)式光合磷酸化，為硝酸還原酶與亞硝酸還原酶提供更多的還原力。硝酸根利用的增加與蛋白質(zhì)含量的增加是一致的。EPS分泌的減少可能的原因是EPS 呈現(xiàn)酸性[13-15]，具有降低培養(yǎng)液pH值的作用，加有NaNO3的培養(yǎng)液的pH值相比NaNO3空白對照有所降低，因此導(dǎo)致EPS分泌的減少。

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