李取勝，王偉，韓秋俊，王鵬龍，李強，雷海民

[摘要] 目的：探討原兒茶酸（protocatechuic acid，PCA）及其衍生物體外清除DPPH自由基活性及對雞胚絨毛尿囊膜（chick chorioallantoic membrane， CAM）血管新生的影響。方法：利用芐基保護及芐酯水解等相關(guān)反應(yīng)，得到PCA系列衍生物PCA-1，PCA-2，PCA-3，結(jié)構(gòu)經(jīng)1H，¹³C-NMR及MS驗證，并采用DPPH自由基體外抗氧模型、CAM對PCA及其衍生物的活性進行篩選。 結(jié)果：PCA及含有鄰二酚羥基的PCA-1的體外清除DPPH自由基活性較強；PCA，PCA-3對新生血管有一定的抑制作用，而PCA-2則能促進血管的新生（P<0.001）。結(jié)論：PCA分子結(jié)構(gòu)中的鄰二酚羥基為體外清除DPPH自由基的活性部位；不含鄰二酚羥基，同時有羧基時能增強其促血管新生活性，但需要進一步的實驗驗證。

[關(guān)鍵詞] 原兒茶酸；衍生物；DPPH自由基；雞胚絨毛尿囊膜；生物活性

水溶性酚酸類成分原兒茶酸（protocatechuic acid，PCA）廣泛存在于老鸛草、丹參等常見中藥[1-2]以及復(fù)方丹參注射液、冠心寧注射液[3-4]等經(jīng)典復(fù)方制劑。不僅具有顯著降低心肌耗氧量，提高心肌耐氧能力，減慢心率[5]等藥理作用，而且大量文獻(xiàn)報道其具有確切的體外抗氧化活性[6-8]，但并沒有通過實驗的方法尋找其抗氧化活性的位點的報道。本實驗采用芐基保護與芐酯水解的方法對PCA進行結(jié)構(gòu)修飾，并選取體外清除DPPH自由基模型及雞胚絨毛尿囊膜（chick chorioallantoic membrane， CAM）模型來研究PCA及其衍生物的體外抗氧化活性及對血管新生作用的影響，并探索PCA相關(guān)活性的活性位點。

1 材料

雙線恒溫加熱磁力攪拌器SH-3A（北京金紫光科技發(fā)展有限公司），RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），分析天平（德國賽多利斯公司），LC-MS 2020（Shimadzu公司），Avance 500型核磁共振儀（F llanden， Switzerland），X-5顯微熔點測定儀（北京泰克儀器有限公司），酶標(biāo)儀specta Max190（美國Molecular Devices），PH計（梅特勒-托利多儀器有限公司），96孔板（美國Costar公司），雞胚孵化箱（北京方通孵化器廠），顯微鏡（日本Olympus公司320040型），CJT型超凈工作臺（北京長城空氣凈化工程公司）。

原兒茶酸（南京澤郎醫(yī)藥科技）；氯化芐、Vit C（北京化工廠）；DPPH、叔丁基對苯二酚（TBHQ， 阿拉丁試劑）；二甲基亞砜（DMSO，Amresco公司）；雞胚（北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司）；吸附性明膠海綿（南京金陵制藥）。

2 方法與結(jié)果

2.1 PCA衍生物的合成設(shè)計

PCA結(jié)構(gòu)中含有鄰二酚羥基、羧基，要確定體外抗氧化活性位點，必須對其官能團進行選擇性保護。芐基保護常被用于有機合成反應(yīng)中，易與羧基、羥基選擇性結(jié)合，尤其在鄰二酚羥基保護中應(yīng)用較多[9-11]，且芐基本身沒有其他官能團，故從實驗操作簡單角度選擇將PCA與溴化芐反應(yīng)，分別得其衍生物PCA-1， PCA-2和PCA-3，主要設(shè)計路線及方法見圖1。

2.2 PCA衍生物的合成

2.2.1 化合物PCA-1的合成 取2.46 g PCA，溶解在20 mL干燥的二甲基甲酰胺（DMF）中，0.64 g氫氧化鈉溶于4 mL水并逐滴加入到DMF，混合液在冰浴下逐滴加入氯化芐1.85 mL，繼續(xù)攪拌20 min。室溫下攪拌20 h，升溫到50 ℃攪拌2 h。乙酸乙酯萃取3次，有機層依次水洗、飽和碳酸氫鈉洗、飽和氯化鈉洗，無水硫酸鎂干燥，過濾，回收乙酸乙酯得棕色固體，甲苯反復(fù)洗滌并干燥得到白色固體1.26 g，收率43%。mp 147～148 ℃。LC-MS m/z

a. 氯化芐/氫氧化鈉/二甲基甲酰胺/水， 室溫20 h，50 ℃ 2 h； b. 氯化芐/碳酸鉀/二甲基甲酰胺， 85 ℃，過夜； c. 氫氧化鉀， 水-乙醇 1∶2 ，70 ℃，2 h。

圖1 PCA衍生物的合成路線

Fig.1 Synthesis of PCA derivants

245.1 [M+H]⁺；¹H-NMR（DMSO-d₆，500 Hz）δ： 5.28（2H，s，1′-CH₂-），6.83（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），7.34～7.45（7H，m，Ar-H），9.40（1H，s，4-OH），9.81（1H，s，3-OH）；¹³C-NMR（DMSO-d₆，125 Hz）δ： 165.9（C-7），151.1（C-4），145.6（C-3），137.0（C-2′），129.0（C-4′，6′），128.5（C-5′），128.4（C-3′，7′），122.4（C-1），120.9（C-6），116.8（C-5），115.9（C-2），66.1（C-1′），與文獻(xiàn)[12]相當(dāng)。

2.2.2 化合物PCA-3的合成 取1 g PCA溶于20 mL干燥DMF中，攪拌下加入2.96 g干燥的碳酸鉀，室溫下逐滴加入2.98 mL氯化芐并持續(xù)攪拌10 min，之后在氮氣保護下85 ℃攪拌過夜。反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫，加100 mL水，用氯仿萃取3次（3×100 mL）。合并有機層，依次水洗、飽和氯化鈉洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，回收氯仿得到油狀物。將油狀物通過硅膠柱，石油醚-丙酮（10∶1）為洗脫液，得到2.3 g白色固體，收率83.6%。mp 66～68 ℃；LC-MS m/z 425.2 [M+H]⁺；¹H-NMR（CDCl3，500 Hz）δ： 5.23（2H，s，1″-CH₂-），5.26（2H，s，1-CH₂-），5.35（2H，s，1′-CH₂-），6.95（1H，d，J=9.0 Hz，H-5），7.35～7.51（15H，m，Ar-H），7.70～7.71（2H，m，H-2，6）；¹³C-NMR（CDCl3，125 Hz）δ： 166.1（C-7），153.0（C-4），148.3（C-3），136.8（C-2），136.5（C-2″），136.3（C-2′），128.7（C-4，6），128.6（C-4″，6″），128.5（C-4′，6′），128.2（C-5），128.1（C-5″），128.0（C-5′），127.9（C-3，7），127.4（C-3″，7″），127.2（C-3′，7′），124.1（C-1），123.0（C-6），115.5（C-2），113.2（C-5），71.2（C-1），70.8（C-1″），66.6（C-1′）。與文獻(xiàn)[13]一致。

2.2.3 化合物PCA-2的合成 取1.5 g（3.53 mmol）化合物PCA-3于50 mL圓底燒瓶中，加入20 mL乙醇，取1 g（17.85 mmol）氫氧化鉀溶于10 mL水中，慢慢加入燒瓶，反應(yīng)液在70 ℃攪拌至反應(yīng)液呈均一狀態(tài)。蒸去反應(yīng)液中過量乙醇，加100 mL水，冷卻至室溫。逐滴加入4 mol·L^-1鹽酸酸化至不再產(chǎn)生白色沉淀為止（pH 3～4），過濾，水洗，抽濾至干燥，得1.0 g白色固體，收率84.8%。mp 187～188 ℃；LC-MS m/z 335.2 [M+H]⁺；¹H-NMR（DMSO-d₆，500 Hz）δ： 5.18（2H，s，1″-CH₂-），5.23（2H，s，1′-CH₂-），7.16（1H，d，J=9.0Hz，H-5），7.31～7.47（10H，m，Ar-H），7.56～7.53（2H，m，H-2，6），12.3（1H，br s，-COOH）；¹³C-NMR（DMSO-d₆，125 Hz）δ： 167.5（C-7），152.5（C-4），148.0（C-3），137.5（C-2″），137.2（C-2′），129.0（C-4″，6″），128.9（C-4′，6′），128.4（C-5″），128.3（C-5′），128.0（C-3″，7″），127.9（C-3′，7′），124.0（C-6），123.7（C-1），115.0（C-2），113.5（C-5），70.4（C-1″），70.3（C-1′）。與文獻(xiàn)[13-14]相當(dāng)。

2.3 活性篩選

2.3.1 體外清除DPPH自由基活性篩選[15-18] 于DMSO中將Vit C，TBHQ，PCA及其衍生物PCA-1，PCA-2和PCA-3配制成質(zhì)量濃度為10.0 g·L^-1的溶液，其中Vit C，TBHQ為陽性對照藥物；通過DPPH自由基清除實驗對上述化合物進行篩選，以確定PCA體外抗氧化活性的作用位點。

在96孔板中，每個樣品重復(fù)3次，待樣品和95%乙醇全部加完后，再加入0.1 mmol·L^-1 DPPH的95%乙醇溶液，室溫下避光反應(yīng)20 min，在517 nm處測定吸光度A；DPPH自由基清除率=[1-（As-A0）/Ac] ×100%。其中，樣品組（As）：20 μL樣品+180 μL DPPH自由基溶液；對照組（Ac）：20 μL DMSO +180 μL DPPH自由基溶液；空白組（A0）：20 μL樣品+180 μL 95%乙醇。

2.3.2 對CAM模型的作用 參照文獻(xiàn)[19-20]，在無菌環(huán)境下給藥組加入PCA，PCA-1，PCA-2和PCA-3，給藥劑量為30 μg/雞胚；空白組加生理鹽水。采用Image-Pro Plus5.0軟件計數(shù)由載體輻射新生血管（直徑<100 μm）數(shù)目。

2.4 結(jié)果

2.4.1 清除DPPH自由基活性結(jié)果 當(dāng)樣品在反應(yīng)體系中質(zhì)量濃度為1 g·L^-1時，以Vit C，TBHQ為陽性對照，PCA及其衍生物對DPPH自由基清除率見表1。

2.4.2 CAM模型篩選結(jié)果 加藥72 h后在解剖顯微鏡下觀察給藥組與空白組的CAM新生血管生長情況，發(fā)現(xiàn)給藥組PCA-2中新生毛細(xì)血管從載體邊緣輻射狀發(fā)出，其數(shù)目與空白組相比有所增多，其他幾組則不顯著。說明衍生物PCA-2對CAM新生血管有顯著性促進作用，見表2。

3 討論及結(jié)論

在PCA衍生物的合成過程中，均是參照文獻(xiàn)的操作來進行，但是PCA-1的產(chǎn)率（43%）與文獻(xiàn)[12]較高的產(chǎn)率（>80%）有較大差距，分析原因是堿水加入的速度對反應(yīng)的影響較大，速度越快，酚羥基也會被活化，副產(chǎn)物就會增多，所以加入堿水速度較慢時能提高反應(yīng)產(chǎn)率。同時，可考慮采用較弱的堿，如碳酸氫鈉、碳酸鉀等。PCA-3的合成也可采用溴化芐，其反應(yīng)速率在常溫時就比較快，但其相對氯化芐價格較貴。故采用氯化芐時，為提高反應(yīng)速率可提高溫度或者在反應(yīng)液中加入碘化鉀。PCA-2由PCA-3水解得到，屬常規(guī)反應(yīng)。

抗氧化實驗結(jié)果得出在體系質(zhì)量濃度為1 g·L^-1時，比較PCA，PCA-1，PCA-2，PCA-3對DPPH自由基清除作用， 初步驗證了PCA體外清除DPPH自由基的活性位點為分子中鄰二酚羥基。

對于血管新生實驗，在藥物濃度為30 μg/雞胚時，PCA與PCA-3對血管新生有一定的抑制作用，但相對于空白組P>0.05（PCA： P=0.373；PCA-1： P=0.593；PCA-3： P= 0.063），組間差別不大。而PCA-2的新生血管數(shù)目為10.75±3.19，相對空白組P<0.001，說明衍生物PCA-2能促進血管的新生。比較上述衍生物的結(jié)構(gòu)，可推測在PCA結(jié)構(gòu)中不含鄰二酚羥基，同時存在羧基時有促血管新生活性，但這需要進一步驗證。

本實驗采用芐基保護的方法，對PCA的不同位點進行修飾，得其衍生物，該合成方法成熟，易操作。并采用DPPH自由基體外抗氧模型、CAM模型對PCA及其衍生物的活性進行篩選，為酚酸類或具有類似結(jié)構(gòu)的化合物的結(jié)構(gòu)修飾與相關(guān)活性研究提供了一定的參考。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 張善玉，姜艷玲，樸惠順，等. HPLC測定老鸛草中的原兒茶酸[J]. 華西藥學(xué)雜志， 2007， 22（4）： 453.

[2] 芮建中，鄒漢法，袁倚盛，等. 毛細(xì)管電泳法分離丹參水溶性有效成分——丹參素、原兒茶醛和原兒茶酸[J].中草藥，2000， 31（5）： 337.