汪孟曦，李文蘭，張爭(zhēng)，魏建和，楊云，徐艷紅，梁良

[摘要] 目的：對(duì)國(guó)產(chǎn)沉香的源植物白木香Aquilaria sinensis查爾酮合酶（chalcone synthase，CHS）基因AsCHS1編碼區(qū)進(jìn)行克隆，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)分析。方法：根據(jù)已報(bào)道的白木香傷害轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序結(jié)果分析獲得1條具有查爾酮合酶保守結(jié)構(gòu)域的CHS基因序列，采用RT-PCR技術(shù)，以不同傷害時(shí)間白木香木質(zhì)部混合樣品總RNA為模板克隆得到白木香AsCHS1的基因編碼區(qū)序列，并對(duì)AsCHS1蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析。另外，采用qRT-PCR方法，以組蛋白（histones）為內(nèi)參對(duì)AsCHS1基因在傷害脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果：序列分析表明，所克隆的AsCHS1基因編碼區(qū)開(kāi)放閱讀框（opening reading frame， ORF）長(zhǎng)為1 194 bp，編碼397個(gè)氨基酸殘基，命名為AsCHS1。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證明該基因表達(dá)量在傷害后12 h最大，說(shuō)明該基因能夠在早期響應(yīng)傷害脅迫。結(jié)論：白木香AsCHS1基因的編碼區(qū)序列的分離克隆為進(jìn)一步研究AsCHS1蛋白在白木香中黃酮合成途徑中的功能及表達(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 查爾酮合酶；白木香；黃酮合成

國(guó)產(chǎn)沉香為瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg含樹(shù)脂的木材。作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，沉香有具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效，用于胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急[1]。沉香為極珍貴芳香類(lèi)藥材，因其產(chǎn)量低、價(jià)格高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足市場(chǎng)的需求。沉香葉的資源豐富，探討沉香葉代替沉香藥材的可行性是沉香研究開(kāi)發(fā)中的一個(gè)重要研究方向。通過(guò)對(duì)沉香葉提取物的化學(xué)成分及藥理研究，沉香葉中含有多糖、黃酮、苷類(lèi)及酚類(lèi)等化學(xué)成分[2-6]，具有鎮(zhèn)靜、抗炎、止血、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[7]。其中，黃酮類(lèi)物質(zhì)，如芫花素、木樨草素等均具有藥理活性[8]。合成黃酮類(lèi)化合物的關(guān)鍵酶之一是查爾酮合成酶（CHS）。通過(guò)研究查爾酮合成酶基因的結(jié)構(gòu)，表達(dá)方式，在沉香中的黃酮合成和累積等方面，有助于明確白木香沉香中黃酮合成的分子機(jī)制，探索利用沉香中CHS基因提高沉香中的黃酮含量的可能性。本研究通過(guò)高通量測(cè)序獲得CHS基因的cDNA全長(zhǎng)序列，對(duì)其序列特征進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)研究該基因在處理不同時(shí)間的愈傷組織中的表達(dá)及積累情況，為進(jìn)一步研究沉香中黃酮次生代謝調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

2010年5月于海南省?？谑醒葚S鎮(zhèn)采集三年生栽培白木香A. sinensis莖（次生木質(zhì)部已完全分化），經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所魏建和研究員鑒定，憑證標(biāo)本保存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所（憑證號(hào)2010003）。酒精燈火焰滅菌枝剪，待冷卻后全斷桿傷害處理2，6，12，24 h后，取全斷桿橫切面下1 cm厚的莖，剝?nèi)?shù)皮后立即用液氮冷凍，存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

大腸桿菌DH Escherichia coli 5α感受態(tài)、Taq Plus DNA Polymerase均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；Total RNA Purification Kit 購(gòu)于美國(guó)LC Science公司； M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit，SYBR Premix Ex Taq，pMD19-T載體均為日本寶生物公司產(chǎn)品。本研究所用引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成?；驕y(cè)序由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成。

PTC-200型梯度PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad），Nano-Drop 2000核酸/蛋白定量?jī)x（Thermo），臺(tái)式高速離心機(jī)（Eppendorf），IQ5熒光定量PCR儀（Bio-Rad），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad），制冰機(jī)（Sanyo），超低溫冰箱（Sanyo），高壓蒸氣滅菌鍋（Sanyo）。

2 方法

2.1 白木香CHS基因的搜索和分析

張爭(zhēng)等[9]報(bào)道了通過(guò)高通量測(cè)序方法對(duì)三年生的白木香傷害轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序拼接，并通過(guò)與Swissprot、非冗余核酸數(shù)據(jù)庫(kù)（Nt）、非冗余的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（Nr）和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Kegg）公共數(shù)據(jù)庫(kù)（E≤1×10-5）比對(duì)獲得了注釋結(jié)果。根據(jù)KEGG注釋的基因功能信息，對(duì)參與次生代謝的序列（按次生代謝物種類(lèi)） 進(jìn)行分類(lèi)。對(duì)所有注釋信息整理，搜索黃酮類(lèi)化合物生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因。

2.2 白木香總RNA的提取和cDNA合成

取傷害處理的白木香莖，在液氮中研磨，依據(jù)LC Science公司Total RNA Purification Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，利用NanoDrop 2000進(jìn)行含量測(cè)定和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。利用TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit試劑盒將白木香總RNA反轉(zhuǎn)錄為第一鏈互補(bǔ)鏈DNA （cDNA）。反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件及程序均按照TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.3 白木香AsCHS1 基因的克隆

從白木香轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序結(jié)果中獲得1個(gè)由7條表達(dá)序列標(biāo)簽拼接而成的1 368 bp的序列，經(jīng)注釋分析發(fā)現(xiàn)此片段是具有完整開(kāi)放閱讀框的CHS基因，其開(kāi)放閱讀框?yàn)? 194 bp，定名為AsCHS1。依據(jù)其兩端序列利用Primer軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，序列見(jiàn)表1。以白木香總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，按照下列體系對(duì)白木香的查爾酮合酶基因進(jìn)行擴(kuò)增：cDNA 3 μL， 10×Pfu buffer 5 μL，dNTP （2.5 mmol·L^-1） 4 μL，Taq Plus （2.5 U·μL^-1） 1 μL，10 μmol 引物各1 μL，終體積為50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸反應(yīng)10 min，4 ℃保存。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，切膠回收。將回收的PCR產(chǎn)物與pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化到DH5α菌株，在氨芐抗性平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，再經(jīng)PCR檢測(cè)后送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測(cè)序。

2.4 AsCHS1基因信息學(xué)分析

基因的分析工具AsCHS1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)采用ExPASy Proteomics Server提供的在線(xiàn)工具Protparam （http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）；采用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和結(jié)構(gòu)域的三維建模，氨基酸序列比對(duì)利用ClustalW方法進(jìn)行，通過(guò)MEGA 4.0構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2.5 白木香AsCHS1基因在不同傷害處理時(shí)間的表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）的方法檢測(cè)白木香愈傷組織中CHS基因在其不同傷害處理時(shí)間（對(duì)照CK，2，6，12，24 h）的表達(dá)情況。分析使用SYBR Green I熒光染料法，在qRT-PCR儀上進(jìn)行。選取白木香Histone基因[10]作為目標(biāo)基因定量表達(dá)的內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系中含有5 μL SYBR Premix Ex Taq酶，上下游引物（10 μmol·L^-1） 各0.5 μL，模板（50 mg·L^-1） 0.5 μL，ddH2O 3.5 μL，總體10 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s；59 ℃退火/延伸30 s （每次循環(huán)后采集熒光），40個(gè)循環(huán)；95 ℃變性10 s，65～95 ℃做熔解曲線(xiàn)分析，每個(gè)溫度以每步0.5 ℃上升，每個(gè)溫度停留5 s。試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Excel進(jìn)行分析，獲得AsCHS1基因的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果與分析

3.1 白木香AsCHS1基因篩選

基于序列相似性搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列信息對(duì)未知功能的序列進(jìn)行注釋。對(duì)白木香unigenes與核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（SwissProt，KEGG，Nr，Nt）進(jìn)行BLASTN程序搜索。搜索結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中1條contig12370，長(zhǎng)1 247 bp，由7條reads拼接而成，具有完整的蛋白編碼區(qū)，并對(duì)其進(jìn)行了研究。

3.2 白木香AsCHS1 基因的克隆

根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果，以白木香的cDNA為模板，利用PCR方法擴(kuò)增獲得1個(gè)1 194 bp的基因序列，397個(gè)氨基酸，GenBank登陸號(hào)JX573534。白木香CHS基因PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1?；蛎麨锳sCHS1，將其連接pMD19-T載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI的Blast比對(duì)，確定其擴(kuò)增產(chǎn)物為白木香CHS基因cDNA的片段。

3.3 白木香AsCHS1 基因編碼蛋白特性分析

3.3.1 理化性質(zhì) 白木香AsCHS1基因全長(zhǎng)1 194 bp，編碼397個(gè)氨基酸，利用ExPASy Proteomics Server提供的在線(xiàn)工具Protparam對(duì)基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，推測(cè)該蛋白的分子式為C1939H3093N521O569S14，相對(duì)分子質(zhì)量為43 kD，等電點(diǎn)pI 6.10；帶正電殘基（Arg+Lys）為40，負(fù)電殘基（Asp+Glu）為44。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為45.07，脂肪系數(shù)為98.87，親水性系數(shù)為0.014。

3.3.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)建模 二級(jí)結(jié)構(gòu)在線(xiàn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，有163個(gè)氨基酸參與形成α-螺旋（alpha helix），占所有氨基酸的41.06%，有28個(gè)氨基酸參與形成伸展鏈（extended strand），占總氨基酸的9.57%，另有196個(gè)氨基酸參與形成無(wú)規(guī)則卷曲（random coil），占總氨基酸的49.37%（http：//www.predictprotein.org/）。

利用SWISS-MODEL進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[11]，通過(guò)PyMOL Viewer作圖，三維模型見(jiàn)圖2。用于建立該模型的氨基酸殘基為6～390位，該模型以1cgzA（1.70 A）蛋白[12]為模板，序列同源性為61.8%。

3.4 氨基酸序列比對(duì)和基因進(jìn)化分析

以AsCHS1序列進(jìn)行Blast在線(xiàn)序列比對(duì)，結(jié)果表明AsCHS1基因的核苷酸序列與其他植物CHS基因的相似性較高，利用MEGA 4.0軟件，采用鄰結(jié)法（neighbor-joining， NJ）預(yù)測(cè)的白木香AsCHS1與其他代表性植物的氨基酸序列比對(duì)，見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，AsCHS1與已獲得的白木香CHS有較高的相似性，與葡萄、擬南芥等植物的CHS蛋白相似性達(dá)64%。

3.5 白木香AsCHS1在不同傷害處理時(shí)間的表達(dá)分析

為研究AsCHS1基因在傷害脅迫下的表達(dá)模式，本研究采用qRT-PCR分別檢測(cè)對(duì)照CK及傷害處理2，6，12，24 h后AsCHS1基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示該基因在新鮮愈傷中表達(dá)量較低，該基因在傷害處理的24 h內(nèi)表達(dá)水平顯著升高，在12 h處基因表達(dá)量最高，是對(duì)照組表達(dá)水平的13.12倍，見(jiàn)圖4。

4 討論

黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)天然次生代謝物，廣泛存在于植物中。黃酮在植物的色素積累，抗脅迫，抗菌 及細(xì)胞發(fā)育與分化中起著重要作用，同時(shí)還具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血壓、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)等多種生物活性[13]。查爾酮合酶作為黃酮類(lèi)合成途徑中的關(guān)鍵酶，其基因的突變，沉默或過(guò)表達(dá)會(huì)影響黃酮類(lèi)物質(zhì)的合成，對(duì)其功能和產(chǎn)量產(chǎn)生一定影響。查爾酮合酶基因的表達(dá)受植物激素、營(yíng)養(yǎng)水平、光照、病原菌及機(jī)械傷害等的誘導(dǎo)[14]。本實(shí)驗(yàn)以傷害處理的白木香為材料成功克隆了AsCHS1基因全長(zhǎng)，并采用生物信息學(xué)對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白具有查爾酮合酶典型保守結(jié)構(gòu)域，推測(cè)AsCHS1蛋白可能在白木香具有催化合成黃酮的作用，為進(jìn)一步研究AsCHS1在白木香中黃酮合成途徑中的功能及鑒定酶活性位點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。另外，本實(shí)驗(yàn)中qRT-PCR結(jié)果表明AsCHS1基因的表達(dá)受傷害脅迫誘導(dǎo)，其表達(dá)量在傷害后12 h最大，這為從分子水平上調(diào)控白木香中AsCHS1基因表達(dá)量以及提高白木香中黃酮化合物含量提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Cloning and bioinformatics analysis of chalcone synthase

（AsCHS1） gene in Aquilaria sinensis

WANG Meng-xi1，2， LI Wen-lan1， ZHANG Zheng2，3*， WEI Jiang-he2，3， YANG Yun3， XU Yan-hong2， LIANG Liang4

（1.Drug Research Institute of Life Science and Environment Science， Harbin University of Commerce， Harbin 150076， China；

2. Institute of Medicinal Plant Development，National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials，

Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100193， China；

3. Hainan Branch of Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medicinal Sciences & Peking Union

Medical College， Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine，

Wanning 571533， China； 4. College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Ji′nan 250355， China）

[Abstract] Objective： The study aimed to clone the open reading frame of chalcone synthase （CHS） from Aquilaria sinensis and analyze the bioinformatics and expression of the gene. Method： One unique sequence containing CHS domain was discovered in our previous reported wound transcriptome dataset of A. sinensis. The open reading frame of CHS was cloned by RT-PCR strategy with the template of mixed RNA extracted from A. sinensis stem which treated by different wound time.The bioinformatic analysis of this gene and its corresponding protein was performed. The AsCHS1 expression in calli was analyzed with histone gene as an internal control gene under wound condition by qRT-PCR technique. Result： One unique sequence of CHS， named as AsCHS1， was cloned from A. sinensis. The full length of AsCHS1 cDNA was containing a 1 192 bp ORF that encoded 397 amino acids. The result of qRT-PCR displayed that the highest expression level was at 12 h， which indicated that it was possibly involved in early-stage response to wound. Conclusion： Cloning and analyzing AsCHS1 gene from A. sinensis provided basic information for study the fuction and expression regulation of AsCHS1 in the flavonoids biosynthesis .

[Key words] chalcone synthase； Aquilaria sinensis； flavonoids biosynthesis

doi：10.4268/cjcmm20130202

[責(zé)任編輯 呂冬梅]