李利義 徐斌 羅越 韓紹偉 金洲祥 鄭志強(qiáng)

CXCR4和VEGF-C在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)性

李利義 徐斌 羅越 韓紹偉 金洲祥 鄭志強(qiáng)

目的 探討CXCR4和VEGF-C在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用及兩者的相關(guān)性。 方法 應(yīng)用免疫組化法及RT-PCR檢測(cè)CXCR4及VEGF-C在人胃癌組織中的表達(dá)水平，并分析其與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果 CXCR4及VEGF-C蛋白在癌旁組織中無陽性表達(dá)，在胃癌組織中均呈陽性表達(dá)。胃癌組織中CXCR4及VEGF-C蛋白陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織（P＜0.05或0.01），且N0組織、N1+N2組織、N3組織中CXCR4及VEGF-C蛋白陽性表達(dá)率兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。不同胃癌組織中CXCR4mRNA及VEGF-CmRNA的表達(dá)明顯不同，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。胃癌組織中CXCR4表達(dá)與VEGF-C表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.355，P＜0.01）。 結(jié)論 胃癌中CXCR4和VEGF-C的表達(dá)呈正相關(guān)，兩者的協(xié)同作用與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，進(jìn)一步研究?jī)烧叩淖饔脵C(jī)制可能對(duì)預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及判斷預(yù)后有重要臨床價(jià)值。

CXCR4 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C 胃癌 淋巴轉(zhuǎn)移

胃癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率居惡性腫瘤第二位，占消化道惡性腫瘤的首位。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌死亡的最主要原因，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其最常見的轉(zhuǎn)移方式，有研究表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。趨化因子CXCR4及其配體CXCLl2所構(gòu)成的信號(hào)傳導(dǎo)通路參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白聚合、骨架重排、偽足形成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，與腫瘤器官特異性轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C（VEGF-C）因其可通過激活淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體VEGFR-3，從而促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化并誘導(dǎo)淋巴管生成，進(jìn)而促進(jìn)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，是目前臨床研究的熱點(diǎn)。本研究應(yīng)用免疫組化及RT-PCR方法檢測(cè)CXCR4和VEGF-C在人胃癌組織中的表達(dá)情況，旨在探討CXCR4與VEGF-C在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用及兩者的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2009-12—2010-12在溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院外科行手術(shù)治療的胃癌患者76例，其中男52例，女24例，年齡26～79（57.0±1.8）歲。所有患者術(shù)前均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，均未接受放療或化療[3]。按照日本胃癌協(xié)會(huì)（JGCA）2010年分期標(biāo)準(zhǔn)分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況為：N0者30例，N1者9例，N2者26例，N3者11例。每份標(biāo)本均于術(shù)后10min內(nèi)取材于腫瘤組織及正常胃黏膜組織（距腫瘤組織邊緣＞5cm，作為正常對(duì)照），全部標(biāo)本取材后迅速分成兩份，分別置于10%甲醛溶液中固定和-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 兔抗人VEGF-C試劑盒為北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，鼠抗人CXCR4抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，免疫組化S-P試劑盒購(gòu)自德國(guó)寶靈曼公司。CXCR4、VEGF-C引物由北京奧科生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)?？俁NA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Gibico BRL公司。

1.3 方法

1.3.1 CXCR4和VEGF-C蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化酶染色法。石蠟切片脫蠟，以微波枸櫞酸鹽進(jìn)行抗原修復(fù)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明封片，顯微鏡下觀察，用已知的陽性切片作為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：在組織切片中CXCR4和VEGF-C陽性細(xì)胞主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜染為棕黃色。判定標(biāo)準(zhǔn)：采用雙盲法計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野，陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性，≥10%為陽性，同時(shí)忽略較弱或可疑的染色。

1.3.2 CXCR4 mRNA和VEGF-C mRNA表達(dá)的檢測(cè) 胃癌標(biāo)本從-80℃冰箱內(nèi)取出后，迅速置于研缽中，在液氮中研磨為粉末狀，然后按試劑盒操作說明提取總RNA。取2μg總RNA，依照試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后行PCR擴(kuò)增，以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)對(duì)照。擴(kuò)增引物為：CXCR4前向引物5′-AAGAAACTGAGAAGCATGACC-3′，后向引物5′-GAAACTGGAACACAACCACC-3′，擴(kuò)增片段大小為293bp。VEGF-C前向引物5′-AATGTGGGGCCAACCGAGAA-3′，后向引物5′-CCAATATGAAGGGACACAACG-3′，擴(kuò)增片段大小為285bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)成像，計(jì)算條帶的光密度值。結(jié)果判定：以同一模板CXCR4或VEGF-C與GAPDH的條帶灰度的比值作為CXCR4或VEGF-C的表達(dá)指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 CXCR4及VEGF-C蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況比較 見表1。

由表1可見，CXCR4及VEGF-C蛋白在癌旁組織中無陽性表達(dá)，在胃癌組織中均呈陽性表達(dá)（圖1-2）。胃癌組織中CXCR4及VEGF-C蛋白陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織（P＜0.05或0.01），且N0組織、N1+N2組織、N3組織中CXCR4及VEGF-C蛋白陽性表達(dá)率兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

表1 CXCR4及VEGF-C蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況比較（例）

圖1 胃癌組織中CXCR4陽性表達(dá)（DAB顯色，×400）

圖2 胃癌組織中VEGF陽性表達(dá)（DAB顯色，×400）

2.2CXCR4mRNA及VEGF-CmRNA在胃癌組織中的表達(dá)情況比較 見圖3、表2。

圖3 不同胃癌組織中CXCR4mRNAVEGF-CmRNA的表達(dá)情況

由圖3及表2可見，不同胃癌組織中CXCR4mRNA及VEGF-CmRNA的表達(dá)明顯不同，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

2.3 胃癌組織中CXCR4與VEGF-C表達(dá)的相關(guān)性 見表3。

由表3可見，胃癌組織中CXCR4表達(dá)與VEGF-C表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.355，P＜0.01）。

表2 不同胃癌組織中CXCR4mRNA及VEGF-CmRNA的表達(dá)指數(shù)

表3 胃癌組織中CXCR4與VEGF-C表達(dá)的相關(guān)性（例）

3 討論

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌主要的轉(zhuǎn)移途徑，也是胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，研究淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，控制淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，已成為臨床治療胃癌的重要環(huán)節(jié)，也為治療胃癌的藥物研究提供了新的靶點(diǎn)。

趨化因子CXCL12與其特異性受體CXCR4所構(gòu)成的CXCL12-CXCR4生物學(xué)軸在多種腫瘤的播散和器官特異性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。CXCR4是神經(jīng)纖毛蛋白-1（Neuropilin-1，NRP-1）的下游分子，是一個(gè)編碼352個(gè)氨基酸且高度保守的G蛋白偶聯(lián)七次跨膜受體。惡性腫瘤細(xì)胞高表達(dá)趨化因子受體CXCR4，并可能在CXCL12趨化、牽引下致使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至作為配體產(chǎn)生源的某些器官（如肺、骨、肝、腎、淋巴結(jié)等），從而形成器官特異性的轉(zhuǎn)移[4-6]。

Muller等[7]首次報(bào)道人乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌組織中高表達(dá)趨化因子受體CXCR4，而在乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位如淋巴結(jié)、肺、肝臟和骨髓則高表達(dá)其配體CXCL12，提示趨化因子及其受體的同步高表達(dá)在決定乳腺癌器官特異性轉(zhuǎn)移的過程中起著非常關(guān)鍵的作用。Yasumoto等[8]采用免疫組化方法檢測(cè)胃癌組織中CXCR4的表達(dá)，結(jié)果顯示伴有腹膜轉(zhuǎn)移的胃癌組織中CXCR4的陽性率為67%，顯著高于無腹膜轉(zhuǎn)移者的25%。蘇一樂等[9]的研究證明，CXCR4在子宮頸癌向盆腔淋巴結(jié)組織轉(zhuǎn)移中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，CXCR4在癌旁正常胃組織中無陽性表達(dá)，顯著低于N0組胃癌組織中的表達(dá)率；N1+N2組織中CXCR4陽性表達(dá)率明顯高于N0組織；且N0及N1+N2組織中CXCR4陽性表達(dá)率均明顯低于N3組織；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，隨著胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的增加，CXCR4 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。以上結(jié)果提示CXCR4的表達(dá)可能促進(jìn)胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其可能機(jī)制為胃癌組織高表達(dá)CXCR4與淋巴結(jié)選擇性高表達(dá)其特異性配體CXCL12，從而促進(jìn)胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移。

VEGF-C是新生血管形成的重要調(diào)控因子，可以通過與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGF受體結(jié)合，增加淋巴管的通透性，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增生，誘導(dǎo)淋巴管的生成[10]。本文結(jié)果顯示，VEGF-C在癌旁正常胃組織中陽性表達(dá)率為9.21%，顯著低于N0組織中的陽性表達(dá)率（40%）；N1+N2組織中CXCR4陽性表達(dá)率明顯高于N0組織；且N0及N1+N2組織中CXCR4陽性表達(dá)率均明顯低于N3組織；另外，隨著胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的增加，VEGF-C mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。以上結(jié)果提示VEGF-C可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其表達(dá)水平的增高可能促進(jìn)腫瘤淋巴管的生成及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。

此外，本研究結(jié)果還顯示，CXCR4和VEGF-C的表達(dá)呈正相關(guān)，說明兩者在胃癌的發(fā)展中存在協(xié)同作用。有淋巴轉(zhuǎn)移的46例胃癌標(biāo)本中有34例表達(dá)CXCR4，有36例表達(dá)VEGF-C；在33例共同表達(dá)CXCR4和VEGF-C的胃癌標(biāo)本中有28例存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。這些證據(jù)表明CXCR4、VEGF-C與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Tao等[11]發(fā)現(xiàn)，VEGF-C和NRP-1結(jié)合可以增強(qiáng)腫瘤的存活能力和侵襲活性。因此筆者認(rèn)為，VEGF-C可能通過某種機(jī)制調(diào)節(jié)CXCR4的產(chǎn)生或表達(dá)，形成VEGF-C-NRP-1-CXCR4信號(hào)通路，協(xié)同促進(jìn)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究CXCR4和VEGF-C在胃癌淋巴轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，可能為評(píng)估胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況提供新的生物學(xué)指標(biāo)，亦可能為胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移找到新的治療途徑。

[1] DegiuliM,BorasiA,Forchino F,et al.Lymph-nodalratio in gastric cancer staging system[J].Minerva Chir,2011,66(3):177-182.

[2] Kucia M,Reca R,Miekus K,et al.Trafficking of normal stem cells and metastasis of cancer stem cells involve similar mechanisms: pivotal role of the SDF-1-CXCR4 axis[J].Stem Cells,2005,23(7): 879-894.

[3]徐斌,韓紹偉,周笑珍,等.CXCR4和MMP-9在胃癌組織中表達(dá)及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2012,42(4):112-115.

[4] Saur D,Seidler B,Schneider G,et al.CXCR4 expression increases liver and lung metastasis in a mouse modelof pancreatic cancer[J].Gastroenterology,2005,129(4):1237-1250.

[5] Xiang Z,Zeng Z,Tang Z,et al.Increased expression of vascularendothelial growth factor-C and nuclear CXCR4 in hepatocellular carcinoma is correlated with lymph node metastasis and poor outcome[J].Cancer J,2009,15(6):519-25.

[6] Mukherjee D,Zhao J.The Role of chemokine receptor CXCR4 in breast cancer metastasis[J].Am J Cancer Res,2013,3(1):46-57.

[7] Muller A,Homey B,Soto H G,et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis[J].Nature,2001,410:50-56.

[8] Yasumoto K,Koizumi K,Kawashima A,et al.Role of the CXCL12/CXCR4 axis in peritoneal carcinomatosis of gastric cancer [J].Cancer Res,2006,66(4):2181-2187.

[9] 蘇一樂,宋靜慧,吉亞南.子宮頸癌和盆腔淋巴結(jié)組織中趨化因子受體CXCR4及其配體CXCL12基因DNA的表達(dá)及其意義[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2006,41(10):717-719.

[10] He Y,Karpanen T,Alitalok.Role of lymphangiogenic factors in tumor metastasis[J].Biochimica Biophysica Acta,2004,1654(1): 3-12.

[11] Tao J,LiT,LiK,et al.Effect of HIF-1 alpha on VEGF-C induced lymphangiogenesis and 1ymph nodes metastases of pancreatic cancer[J].J Huazhong Univ SciTechnolog Med Sci,2006,26(5): 562-564.

Association of CXCR4 and VEGF-C with lymphatic metastasis in gastric cancer

LI Liyi,XU Bin,LUO Yue,et al.
Department of General Surgery,The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Whenzhou 325027,China

Objective To investigate the association of CXCR4 and VEGF-C with lymphatic metastasis in gastric cancer. Methods The expressions of CXCR4 and VEGF-C proteins and mRNAs in human gastric cancer were detected by immunohistochemistry and RT-PCR,respectively.The relationship between CXCR4 and VEGF-C expressions and lymph node metastasis of gastric cancer was analyzed. Results CXCR4 and VEGF-C proteins were positively expressed in gastric cancer tissue,while they were not detected in pericancerous gastric tissue.The positive rate of CXCR4 and VEGF-C protein expression in gastric cancer tissue was significantly higher than that in pericancerous gastric tissue(P＜0.05 or 0.01).There were significant differences in positive expression rates of CXCR4 and VEGF-C proteins and mRNAs among stage N0,N1+N2and N3gastric cancers(P＜0.05或0.01).The expression level of CXCR4 was positively correlated with that of VEGF-C(r=0.355,P＜0.01). Conclusion The synergy of CXCR4 and VEGF-C was closely related to the lymphatic metastasis of gastric cancer,and further study on the mechanism may has important clinical value in predicting lymph node metastasis and prognosis.

CXCR4 VEGF-C Gastric cancer Lymphatic metastasis

2013-04-01）

（本文編輯：歐陽卿）

溫州市科技計(jì)劃基金資助項(xiàng)目（Y20090061）；溫州市甌海區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（20090137）

325027 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院普外科（李利義、羅越、韓紹偉、金洲祥、鄭志強(qiáng)）；溫州市甌海區(qū)人民醫(yī)院普外科（徐斌）