朱金土 劉波 車菲 尚興紅 高壽松

●論 著

人脂肪干細(xì)胞復(fù)合珊瑚支架在三維培養(yǎng)下成骨活性的初步研究

朱金土 劉波 車菲 尚興紅 高壽松

目的 探討人脂肪干細(xì)胞（ADSCs）作為種子細(xì)胞復(fù)合珊瑚支架材料在體外三維培養(yǎng)下的成骨活性。 方法 取行脂肪抽吸術(shù)患者的脂肪組織，I型膠原酶消化進(jìn)行培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞傳代，取第2代細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)基中添加成骨誘導(dǎo)劑地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸和維生素D3。成骨誘導(dǎo)后復(fù)合珊瑚繼續(xù)培養(yǎng)，以未誘導(dǎo)的ADSCs復(fù)合物為對(duì)照，進(jìn)行生長曲線、DIO染色后的共聚焦熒光顯微鏡、堿性磷酸酶（AKP）和骨鈣蛋白（OCN）生物化學(xué)定量檢測(cè)。 結(jié)果 7～8d后ADSCs在材料上生長進(jìn)入平臺(tái)期，誘導(dǎo)ADSCs復(fù)合珊瑚7d后生長良好。誘導(dǎo)ADSCs AKP表達(dá)隨著時(shí)間的推移不斷增強(qiáng)，而且在檢測(cè)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，誘導(dǎo)ADSCs AKP表達(dá)水平均明顯高于未誘導(dǎo)ADSCs（均P＜0.05）。誘導(dǎo)ADSCs在珊瑚支架上第7天后檢測(cè)到OCN表達(dá)，并一直增高，且從第7天開始OCN表達(dá)均明顯高于未誘導(dǎo)ADSCs（均P＜0.05）。 結(jié)論 脂肪干細(xì)胞復(fù)合珊瑚支架在三維培養(yǎng)下能夠向成骨細(xì)胞表型分化。

脂肪干細(xì)胞 珊瑚 堿性磷酸酶 骨鈣蛋白

已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，從人脂肪組織抽吸物中可以獲取脂肪干細(xì)胞（adipose derived stromal cells，ADSCs），在成骨培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)下能夠向成骨細(xì)胞分化[1]。組織工程核心是形成細(xì)胞-支架材料復(fù)合物來修復(fù)缺損，選用何種支架材料能夠使ADSCs在與生物支架材料共培養(yǎng)過程中繼續(xù)保持細(xì)胞的良好生長和成骨活性，仍是需要解決的重要問題。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究提示，干細(xì)胞支架材料復(fù)合物有成骨活性[2-4]，但關(guān)于人ADSCs在支架材料上三維培養(yǎng)情況下的生長和成骨活性情況研究較少。本研究采用人ADSCs復(fù)合珊瑚支架材料進(jìn)行三維培養(yǎng)，并測(cè)定其成骨活性，以期為骨組織工程研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 脂肪抽吸物均來自浙江省中醫(yī)院整形外科門診行脂肪抽吸術(shù)的患者；珊瑚由廣州海洋研究所提供；Ⅰ型膠原酶購自美國Worthington公司；AKP定量檢測(cè)試劑盒購自Sigma公司，OCN定量檢測(cè)試劑盒購自Biomedical technologies公司。DMEM培養(yǎng)液購自美國GIBCO公司、10%的FBS購自美國HYCLONE公司；胰蛋白酶、EDTA購自華美生物工程公司；地塞米松、β-磷酸甘油鈉和2-磷酸抗壞血酸購自Sigma公司，恒溫CO2培養(yǎng)箱購自美國Forma Scientific公司；倒置相差顯微鏡購自日本Nikon公司；SN 695B智能放免測(cè)量儀上海原子核研究所儀器一廠；U-640紫外分光光度計(jì)購自美國Beckman Coulter公司；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀Dialab公司。超聲勻漿機(jī)購自Sonics&Materials公司。

1．2 脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 無菌條件下將脂肪抽吸物用PBS反復(fù)沖洗，爾后移入離心管，加入等體積的0.075%的Ⅰ型膠原酶消化，37°C、1h，加帶血清培養(yǎng)液終止消化，1 380r/min離心10min，棄上清液，用100目細(xì)胞濾器過濾，再次1 380r/min離心5min，棄上清液，加入含10%FBS DMEM低糖培養(yǎng)液混勻細(xì)胞，以2×104/ cm2接種于100mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。24h后，可見梭型細(xì)胞貼壁，每3d更換培養(yǎng)液1次，待細(xì)胞融合至約80%時(shí)進(jìn)行傳代，傳代密度為1×104/cm2。擴(kuò)增到第2代后，換成骨誘導(dǎo)液（0.01μmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μmol/L抗壞血酸和10μmol/L維生素D3）。

1.3 ADSCs在珊瑚支架上的生長曲線測(cè)定 將第2代的誘導(dǎo)和無誘導(dǎo)細(xì)胞各以5×106/ml的細(xì)胞懸液接種密度接種于3mm×3mm×3mm大小的珊瑚材料上，置入96孔板中，加入各自培養(yǎng)液，次日起每天隨機(jī)選擇4孔誘導(dǎo)和無誘導(dǎo)細(xì)胞-材料復(fù)合物，以4孔單純珊瑚作為陰性對(duì)照，每孔加入MTT溶液20μl，37℃孵育4h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150μl二甲基亞砜，振蕩15min裂解細(xì)胞，使沉淀物充分溶解，隨后將溶液移至另一96孔板，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定每孔的光密度值（OD490），以時(shí)間為橫軸，OD490值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4 DIO標(biāo)記細(xì)胞及激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 另將第2代誘導(dǎo)ADSCs收集后制成細(xì)胞懸液，將DIO用無水乙醇配成2mg/ml的溶液，按1μl/10M的濃度標(biāo)記細(xì)胞；標(biāo)記前，將所需體積的DIO溶液用10% FBS DMEM稀釋250倍，加入ADSCs細(xì)胞懸液中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 20min，1 000r/min離心5min，棄上清液，加入PBS沖洗，1 000r/min離心5min，棄上清液，重復(fù)1次。標(biāo)記細(xì)胞以5×106/ml的接種密度滴入3mm×3mm×3mm大小的珊瑚，確保材料被細(xì)胞懸液浸勻。接種4h后加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，隔天換液1次，細(xì)胞材料復(fù)合物于接種后第1、3、5、7天行激光共聚焦熒光顯微鏡觀察，DIO的激發(fā)波長為484nm，發(fā)射波長為501nm。

1.5 ADSCs-珊瑚復(fù)合物體外培養(yǎng)后AKP活性定量檢測(cè) 將第2代的誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)細(xì)胞各以5×106/ml密度接種于3mm×3mm×3mm大小的珊瑚材料上，置入96孔板中，加入各自培養(yǎng)液，隨后次日起在第1、3、7、14、21、28天每天分別各取6塊細(xì)胞-材料復(fù)合物，以6塊單純珊瑚作為陰性對(duì)照。操作步驟簡述如下：（1）stock substrate 40mg溶解于20ml去離子水中；（2）取36支15ml離心管分別標(biāo)記實(shí)驗(yàn)各組，另取1管作為空白組，各放入0.5ml Alkaline Buffer solution和0.5ml stock substrate solution，37℃水浴10min；（3）每塊標(biāo)本置入15ml離心管中，PBS洗凈，將標(biāo)本碾碎，加入3ml Tris（pH值7.4），超聲振蕩粉碎（90s、間隔9s、4℃）；（4）取0.1ml混合震蕩液加入已標(biāo)記的離心管中，空白組加入0.1ml去離子水，繼續(xù)37℃水浴15min；（5）加入10ml 0.05mol/L NaOH終止，405nm紫外分光光度計(jì)測(cè)光密度值（OD值），以空白對(duì)照組進(jìn)行調(diào)零；（6）0.0815OD值=1 Sigma U，1 Sigma U=1μmol ρ-nitrophenol/h。測(cè)定的AKP含量單位為nmol ρ-nitrophenol·min-1·塊-1。

1.6 ADSCs-珊瑚復(fù)合物體外培養(yǎng)后OCN活性定量檢測(cè) 將第2代的誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)細(xì)胞各以5×106/ml密度接種于3mm×3mm×3mm大小的珊瑚材料上，置入96孔板中，加入各自培養(yǎng)液，隨后次日起在第1、3、7、14、21、28天各取6孔細(xì)胞-材料復(fù)合物200μl上清液，再取6孔單純珊瑚200μl上清液作為陰性對(duì)照，-20℃凍存留作檢測(cè)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)標(biāo)本收集齊后按以下步驟進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線和樣本中骨鈣素濃度測(cè)試：（1）各管中均加入100μl125I溶液；（2）實(shí)驗(yàn)組管中加入100μlOCN抗血清；（3）振蕩混勻30s后37℃水浴2.5h；（4）各管中均加入100μl羊抗兔IgG和100μl PEG，室溫放置10min；（5）加入1ml預(yù)冷的緩沖液離心15min（4℃、4 200r/min）；（6）吸棄上清液，計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)1min，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出骨鈣素的相應(yīng)濃度。測(cè)定的OCN含量單位為ng/塊。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS Ver.6.12統(tǒng)計(jì)軟件，所得數(shù)據(jù)均以表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs-珊瑚復(fù)合物體外培養(yǎng)的生長曲線 見圖1。

圖1 ADSCs在珊瑚上的生長曲線

由圖1可見，誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)人ADSCs在支架材料上的生長曲線基本相同，其中在接種到珊瑚后的第1、2天，吸光度值變化不明顯為細(xì)胞的潛伏適應(yīng)期，從第3天開始細(xì)胞迅速增加，第7～8天達(dá)最高，第9天則呈下降趨勢(shì)。細(xì)胞在材料上培養(yǎng)的潛伏期約為24～36h，對(duì)數(shù)增殖期約為3～6d，接種后第7～8天左右進(jìn)入平臺(tái)期。誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)ADSCs在珊瑚上的生長情況在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)皆無明顯差別。

2.2 DIO標(biāo)記細(xì)胞及激光共聚焦熒光顯微鏡觀察情況 接種后第1天，細(xì)胞黏附與支架材料的實(shí)質(zhì)部分或在孔的邊緣上單層排列，細(xì)胞呈均勻的綠色熒光（圖2a）；第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后，細(xì)胞數(shù)量明顯增多（圖2b），至第5天時(shí)細(xì)胞呈多層排列（圖2c）；第7天細(xì)胞覆蓋了大部分材料表面充分伸展，融合成片，熒光強(qiáng)度未見減弱，細(xì)胞和其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)充填于珊瑚的孔隙中，占據(jù)著大部分空間（圖2d）。

2.3 ADSCs-珊瑚復(fù)合物體外培養(yǎng)后AKP活性定量檢測(cè)結(jié)果 見表1。

圖2 激光共聚焦熒光顯微鏡下所見（a：第1天；b：第3天；c：第5天；d：第7天）

表1 ADSCs-珊瑚復(fù)合物體外培養(yǎng)后AKP活性定量檢測(cè)結(jié)果（nmol ρ-nitrophenol·min-1·塊-1）

由表1可見，誘導(dǎo)ADSCs AKP表達(dá)隨著時(shí)間的推移不斷增強(qiáng)，而且在檢測(cè)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，誘導(dǎo)ADSCs AKP表達(dá)水平均明顯高于未誘導(dǎo)ADSCs（均P＜0.05）。

2.4 ADSCs-珊瑚復(fù)合物體外培養(yǎng)后OCN活性定量檢測(cè)結(jié)果 見表2。

表2 ADSCs-珊瑚復(fù)合物體外培養(yǎng)后OCN活性定量檢測(cè)結(jié)果（ng/塊）

由表2可見，誘導(dǎo)ADSCs在珊瑚支架上第7天后檢測(cè)到OCN表達(dá)，并一直增高，且從第7天開始OCN表達(dá)均明顯高于未誘導(dǎo)ADSCs（均P＜0.05）。

3 討論

脂肪干細(xì)胞是近年的研究熱點(diǎn)之一，體外實(shí)驗(yàn)已表明，在平面培養(yǎng)狀態(tài)下，人脂肪干細(xì)胞能夠向成骨細(xì)胞分化[1]。但關(guān)于人脂肪干細(xì)胞復(fù)合材料三維培養(yǎng)狀態(tài)下的成骨狀況卻鮮有報(bào)道。珊瑚作為一種天然材料有著許多人工材料無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，天然珊瑚的孔徑和孔隙率分別為（150±50）μm和（57.60±1.50）%，孔與孔之間都有小孔天然連通形成網(wǎng)絡(luò)樣空間結(jié)構(gòu)，類似于正常骨[5]。珊瑚具有良好的力學(xué)強(qiáng)度，且孔隙率高于30%，是組織工程化骨的良好生物材料[6-7]。

本研究結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)的ADSCs在第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞數(shù)量迅速增加，第7～8天進(jìn)入平臺(tái)期。生長曲線測(cè)定表明，ADSCs在天然珊瑚支架上增殖狀況良好。為了進(jìn)一步觀察三維培養(yǎng)下的細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌情況，本實(shí)驗(yàn)通過DIO（DIO是最常用的細(xì)胞膜熒光探針之一，呈現(xiàn)綠色熒光[8]）標(biāo)記細(xì)胞，然后借助激光共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)成骨誘導(dǎo)的ADSCs第7天細(xì)胞覆蓋了大部分材料表面充分伸展，融合成片，細(xì)胞形態(tài)良好，與其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)充填于珊瑚的孔隙中，占據(jù)著大部分空間。

AKP是成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志，在體內(nèi)鈣化過程中起關(guān)鍵作用，其活性高低可反映成骨細(xì)胞的成熟狀況，AKP活性越高，表明細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的程度越高[9]。本文結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組不同時(shí)點(diǎn)AKP活性隨誘導(dǎo)時(shí)間延長而增強(qiáng)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OCN是骨組織中成骨細(xì)胞合成的特異性蛋白，是骨代謝細(xì)胞分化成熟，處于功能狀態(tài)的標(biāo)志，可作為成骨細(xì)胞活動(dòng)的標(biāo)志性產(chǎn)物[10-11]。本文結(jié)果顯示，在7d后的各個(gè)時(shí)間段誘導(dǎo)的ADSCs-材料組OCN表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，說明在材料上三維生長的情況下，雖然誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)ADSCs都有成骨分化，但誘導(dǎo)ADSCs的成骨活性明顯更強(qiáng)。由此可見，珊瑚材料作為三維支架是適合人ADSCs向成骨誘導(dǎo)分化的，天然珊瑚是ADSCs生長和成骨轉(zhuǎn)化的良好生物支架材料，有可能成為ADSCs的生物支架用于組織工程化骨的構(gòu)建。

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Osteogenesis ability of human adipose stem cells on coral scaffolds in vitro

ZHU Jintu，LIU Bo，CHE Fei，et al.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery，Zhejiang Traditional Chinese Medicine Hospital，Hangzhou 310006,China

Objective To investigate the osteogenic ability of human adipose stem cells(ADSCs)in coral scaffolds in vitros. Methods ADSCs were isolated from liposuction aspirates,then digested by type I collagenase;the passage 2 cells were cultured in conditioned medium containing dexamethasone,β-glycerophosphate,ascorbate-2-phosphate and VD3.The induced cells were co-cultured with coral scaffold and non-induced ADSCs-coral construct served as control.The constructs were examined with growth curve,confocal microscopy and quantitative histochemistry. Results The growth curve demonstrated that the proliferation of ADSCs on coral scaffolds reached plateau after 7-8 d of co-culture.Confocal microscopy and quantitative histochemistry showed that ADSCs grew well and began to express osteocalcin on the coral scaffolds after 7d of culture. Quantitative histochemistry demonstrated that the expressions of alkaline phosphatase(AKP)and osteocalcin(OCN)in induced ADSCs-scaffold were higher than those in non-induced ADSCs-scaffold(P＜0.05). Conclusion The coral scaffold is a good biomaterial for ADSCs growth and being induced to osteoblasts.

Adipose derived stromal cells CoralAlkaline phosphatase Osteocalcin

2012-12-28）

（本文編輯：歐陽卿）

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2080180）

310006 杭州，浙江省中醫(yī)院整形外科