王 荻，劉紅柏

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院/黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 15007)

中草藥具有天然、高效、毒副作用少、資源豐富、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，同時(shí)兼有藥用和營(yíng)養(yǎng)的雙重作用，既可調(diào)節(jié)動(dòng)物的健康狀況，提高水產(chǎn)動(dòng)物性能和飼料利用率，又可改善機(jī)體的免疫機(jī)能，防治水產(chǎn)動(dòng)物病害，是其他禁用抗菌素和化學(xué)藥物的替代產(chǎn)品，在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用中越來(lái)越受到人們的青睞［1］。

目前中草藥作為免疫調(diào)節(jié)劑已逐步應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，關(guān)于牙鲆［2］、鏡鯉［3］、黃顙魚(yú)［4］、異育銀鯽［5］等各種水產(chǎn)動(dòng)物應(yīng)用效果的報(bào)道越來(lái)越多，但是關(guān)于鱘魚(yú)方面的報(bào)道仍較少［6－8］，還需進(jìn)行大量工作篩選適合于鱘魚(yú)的中草藥免疫調(diào)節(jié)劑。

隨著我國(guó)鱘魚(yú)人工繁殖、人工養(yǎng)殖技術(shù)的不斷完善、推廣，這種大型珍貴魚(yú)類(lèi)的養(yǎng)殖范圍逐漸擴(kuò)大，產(chǎn)量逐年遞增，其產(chǎn)量及利潤(rùn)在我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)中所占比例日漸升高。因其獨(dú)特的外貌體征，鮮嫩的肉質(zhì)及豐富的營(yíng)養(yǎng)含量，作為一種名特優(yōu)魚(yú)種，鱘魚(yú)越來(lái)越受到高等餐桌的接納和歡迎，在兼具生態(tài)價(jià)值、觀賞價(jià)值的同時(shí)也具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)集約化、規(guī)?；l(fā)展，健康綠色養(yǎng)殖已成為現(xiàn)代漁業(yè)的必然發(fā)展方向，中草藥作為一種綠色、健康、營(yíng)養(yǎng)的免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物病害防治已成為目前水產(chǎn)行業(yè)研究的熱點(diǎn)。而目前國(guó)內(nèi)關(guān)于鱘魚(yú)用中草藥添加劑的研究仍較少，且未見(jiàn)對(duì)運(yùn)輸、養(yǎng)殖過(guò)程中遇到的高溫應(yīng)激的調(diào)節(jié)方面研究的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選取一種單方和兩種復(fù)方，研究他們對(duì)施氏鱘常溫及熱刺激下特異性免疫功能的影響，為中草藥在鱘魚(yú)這一極具潛力的養(yǎng)殖品種的應(yīng)用上提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康非免疫狀態(tài)下1+齡施氏鱘(Acipenser schrenckii)由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院鱘魚(yú)繁育技術(shù)工程中心提供，平均體質(zhì)量為 0.08 ～0.10 kg。

實(shí)驗(yàn)用中藥均購(gòu)自哈藥集團(tuán)世一堂藥店，烘干粉碎后備用;溶菌酶測(cè)試試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

白細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)采用嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)，所用菌株為實(shí)驗(yàn)室鑒定保存菌株。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中藥方劑及藥液的制備 實(shí)驗(yàn)共選用一種單方及兩種復(fù)方，單方為貫眾，自組復(fù)方一由黃芪、黨參、防風(fēng)、柴胡等組成，復(fù)方二由當(dāng)歸、黃芪等組成。

各方劑按其配比稱(chēng)取中藥，放入砂鍋中，加水浸泡30min，第一次熬45min，將藥汁倒出，再加水熬30min，過(guò)濾，將兩次藥汁合并濃縮成100mL，其中1mL藥液相當(dāng)于1 g中藥方劑(干物質(zhì))的水煎劑，經(jīng)高壓滅菌后存放于冰箱(4℃)中備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)魚(yú)的飼養(yǎng)及樣品采集 隨機(jī)選取施氏鱘于室內(nèi)水族箱(0.90 m×0.50 m×0.45 m)水溫22℃下預(yù)飼兩周，每組兩個(gè)平行，各15尾魚(yú)，保持各水族箱養(yǎng)殖條件均一，每天按魚(yú)體質(zhì)量的2.0%投喂全價(jià)基礎(chǔ)飼料。

預(yù)飼結(jié)束后，按照貫眾每50 kg體質(zhì)量給藥劑量為9 g，方一為175 g，方二為36 g，口灌連續(xù)給藥兩周。給藥結(jié)束后，將半數(shù)魚(yú)放入30℃的控溫水族箱中熱刺激2 h，然后與在正常水溫22℃下的實(shí)驗(yàn)魚(yú)一同取樣。自實(shí)驗(yàn)魚(yú)尾動(dòng)(靜)脈采血，低溫靜置后離心分離血清，并解剖取魚(yú)鰓、肝、幽門(mén)毛囊、胃、腸等各組織樣品，立即于－80℃下保存。

1.3 各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1 樣品的處理 準(zhǔn)確稱(chēng)取實(shí)驗(yàn)魚(yú)組織樣品與預(yù)冷的生理鹽水按1∶9稀釋?zhuān)瑒驖{機(jī)充分勻漿，分別按不同檢測(cè)指標(biāo)及試劑盒所要求的速度和時(shí)間離心，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。血清在37℃下水浴融化后即可檢測(cè)。每個(gè)監(jiān)測(cè)指標(biāo)的樣本數(shù)n=15，均設(shè)平行樣。

1.3.2 生化指標(biāo)的檢測(cè) 采用Beckman公司生產(chǎn)的CYNCHRON CH4PRO全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)指標(biāo)包括:總蛋白、白蛋白、球蛋白、白球比例。

1.3.3 白細(xì)胞吞噬 復(fù)蘇保存的嗜水氣單胞菌菌株，37℃基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基搖菌18 h，將菌液水浴煮沸10min。參照王樹(shù)芹等的方法［9］測(cè)定白細(xì)胞吞噬，采用公式如下:

1.3.4 溶茵酶含量的測(cè)定 施氏鱘血清及各組織溶菌酶測(cè)定方法參照劉紅柏等［10］，溶菌酶的含量計(jì)算公式如下:

其中:Tt——水浴后吸光度At換算出的透光度;T0——水浴前吸光度A0換算出的透光度。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 各項(xiàng)酶活性值數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS軟件最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行處理;生化指標(biāo)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件中的單因子方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，鄧肯氏法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果分析

2.1 施氏鱘血清中蛋白含量及白球比例的變化

對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組施氏鱘血清中總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、球蛋白(globulin，GLU)含量及白球比例(A:G)具體變化情況見(jiàn)表1。表中用高溫標(biāo)記熱刺激組，下同。

表1 施氏鱘血清中TP、ALB、GLU含量及A:G比值的變化Tab.1 Content of TP，ALB，GLU and value of A:G in blood plasma of Amur sturgeon

由表2可見(jiàn)，TP和GLU最高值均出現(xiàn)在常溫貫眾組，而ALB及A∶G的最高值分別出現(xiàn)在高溫貫眾組和常溫方一組。且4個(gè)組別之間TP和ALB均無(wú)顯著性差異，而常溫方一組的GLU含量顯著低于常溫貫眾組，常溫貫眾組的A∶G比值顯著低于常溫方一組和常溫對(duì)照組。且3種血清蛋白的最小值均出現(xiàn)在常溫方一組。

2.2 施氏鱘白細(xì)胞吞噬功能的變化

對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組施氏鱘白細(xì)胞吞噬率PP見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，PP的最大值和最小值分別出現(xiàn)在高溫方一組和高溫方二組，且對(duì)照及方一均表現(xiàn)為熱刺激后PP升高，而方二和貫眾組則降低。且方一和方二PP值受熱刺激影響較大，但只有高溫方一組顯著高于其他所有組別(P＜0.05)，其余各組均未呈現(xiàn)顯著性變化。

白細(xì)胞吞噬的細(xì)菌個(gè)數(shù)及吞噬指數(shù)PI見(jiàn)表2。由表2數(shù)據(jù)可見(jiàn)，各實(shí)驗(yàn)組吞噬細(xì)菌個(gè)數(shù)差別較大，吞噬最大值出現(xiàn)在高溫貫眾組為80個(gè)左右，而最小值高溫方二組為49個(gè)左右。高溫貫眾組的吞噬指數(shù)顯著高于方一組合常溫貫眾組。

圖1 白細(xì)胞吞噬率變化Fig.1 Variety of neutrophil phagocytic rate

2.3 施氏鱘各組織中溶菌酶活性變化

對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組常溫下血清、肝、幽門(mén)毛囊、胃、腸、鰓組織中溶菌酶活性變化情況如圖2所示，而熱刺激后的變化見(jiàn)圖3。

由圖2可見(jiàn)，常溫養(yǎng)殖條件下，各組織中溶菌酶活性差別較大，但是各實(shí)驗(yàn)組測(cè)定結(jié)果呈現(xiàn)較一致的變化趨勢(shì)，均為腸及幽門(mén)毛囊組織中酶活性較高，而血清、胃和鰓組織中活性較低。在平均酶活性最高值出現(xiàn)在腸組織中，為 5.21 μg/g，各組別在該組織中酶活性大小為:方一組＞貫眾組＞對(duì)照組＞方二組，且方一組顯著高于對(duì)照組，極顯著高于方二組。且除了方一組中幽門(mén)毛囊組織外，方一及貫眾實(shí)驗(yàn)組各組織的酶活性均高于對(duì)照組，方一鰓組織中酶活性更是顯著高于其他三組，而方二組各組織中酶活性都偏低。

由圖3可見(jiàn)，高溫刺激后，各組織內(nèi)酶活性的總體分布趨勢(shì)不變，但腸組織內(nèi)酶活性普遍降低，但酶活性大小依然為:方一組＞貫眾組＞對(duì)照組＞方二組，最大值為5.89 μg/g。與常溫相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組相比，方一組肝組織中酶活性顯著提高，鰓組織中極顯著提高。且高溫方一組血清及肝臟中酶活性均顯著(P＜0.05)高于其他3個(gè)高溫刺激實(shí)驗(yàn)組。

表2 中藥方劑對(duì)施氏鱘白細(xì)胞吞噬作用的影響Tab.2 Effect of leukocytic phagocytosis in Amur sturgeon

圖2 常溫下溶菌酶活性變化Fig.2 Variety of lysozyme activity under usual temperature

圖3 熱刺激后溶菌酶活性變化Fig.3 Variety of lysozyme activity after heat stress

3 討論

選用單方貫眾，及自組復(fù)方方一和方二，通過(guò)對(duì)施氏鱘口灌給藥14 d后，對(duì)魚(yú)體內(nèi)各組織中免疫相關(guān)活性物質(zhì)及酶活性的測(cè)定結(jié)果表明，中藥方劑對(duì)施氏鱘非特異性免疫功能有一定的影響，且在高溫刺激下表現(xiàn)出一定的應(yīng)答反應(yīng)。

3.1 中藥方劑對(duì)施氏鱘血液中蛋白含量的影響

魚(yú)類(lèi)血液指標(biāo)被廣泛用來(lái)評(píng)價(jià)魚(yú)類(lèi)的健康狀況、營(yíng)養(yǎng)狀況及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)狀況的生理、病理和毒理學(xué)指標(biāo)［10］。有報(bào)道指出，一些活性多糖能提高魚(yú)類(lèi)飼料利用率及其機(jī)體血糖水平，相應(yīng)的加速了對(duì)葡萄糖的蛋白合成，細(xì)胞分泌到血液中的蛋白量增加，代謝旺盛，致使血清中總蛋白含量也增加，增強(qiáng)蛋白質(zhì)合成代謝，提高魚(yú)體增重率和特定生長(zhǎng)率，從而促進(jìn)魚(yú)體生長(zhǎng)［11－13］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，選用方劑貫眾及方二均有效提高了施氏鱘血漿中總蛋白含量，而方一常溫組隨略低于對(duì)照組，但是高溫刺激組有顯著提升，這樣的結(jié)果與以上研究結(jié)論一致。

而血清中球蛋白含量在一定程度上對(duì)機(jī)體的免疫狀態(tài)有所影響［14］，其含有的γ－球蛋白，對(duì)機(jī)體免疫具有促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)中，除常溫方一組外，其余各組球蛋白含量均高于對(duì)照組，且常溫貫眾組顯著高于常溫方一組。這樣的結(jié)果表明，中藥方劑對(duì)施氏鱘血清中免疫相關(guān)活性物質(zhì)有促進(jìn)作用。

綜上，貫眾及方二口灌給藥14 d，能有效提高施氏鱘血清中總蛋白、白蛋白及球蛋白含量，有利于提高魚(yú)體非特異性免疫能力及促進(jìn)魚(yú)體快速生長(zhǎng)。而方一在常溫養(yǎng)殖下無(wú)顯著作用，但是在應(yīng)答高溫刺激時(shí)，對(duì)魚(yú)體血清中蛋白含量的提升有顯著的促進(jìn)作用。

3.2 中藥方劑對(duì)施氏鱘白細(xì)胞吞噬能力的影響

動(dòng)物體內(nèi)的吞噬細(xì)胞可以吞噬進(jìn)入體內(nèi)的異物，吞噬細(xì)胞在消化病原生物的同時(shí)可保留有關(guān)抗原信息并將其傳遞給相關(guān)的淋巴細(xì)胞，從而激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫。因此，吞噬細(xì)胞的吞噬活性直接與動(dòng)物的免疫機(jī)能有關(guān)。魚(yú)類(lèi)白細(xì)胞對(duì)病原菌的吞噬和殺菌作用也是魚(yú)類(lèi)非特異性免疫的一個(gè)重要方面［15］。

已有研究證實(shí)，在飼料中添加適量的免疫增強(qiáng)劑［16］或免疫多糖［17］能增強(qiáng)魚(yú)類(lèi)非特異性免疫功能，有效提高其白細(xì)胞吞噬活性。而貫眾及方二給藥常溫組白細(xì)胞吞噬率略高于對(duì)照組，而高溫刺激后則略低于對(duì)照組，但并未形成顯著性差異。而方一常溫組略低于對(duì)照組，但高溫刺激后顯著高于所有組別。這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本文所選用的單方貫眾及兩個(gè)復(fù)方對(duì)施氏鱘白細(xì)胞吞噬功能均無(wú)顯著提升，但方一能促進(jìn)機(jī)體在熱刺激情況下做出有益、高效的應(yīng)答反應(yīng)。

3.3 中藥方劑對(duì)施氏鱘各組織中溶菌酶活性的影響

溶菌酶也是魚(yú)類(lèi)抵抗并與菌感染的重要因素［18］，它的量和活性變化是由于免疫物質(zhì)刺激巨噬細(xì)胞分化導(dǎo)致溶菌酶基因復(fù)制來(lái)進(jìn)行的［19］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腸及幽門(mén)毛囊內(nèi)溶菌酶活性較高，而血清和鰓組織內(nèi)較低，與報(bào)道的虹鱒添加免疫調(diào)節(jié)劑在局部消化道內(nèi)的免疫反應(yīng)比系統(tǒng)免疫反應(yīng)變化大［20］相一致。而在中藥方劑的作用下，雖然大部分組織中溶菌酶活性略高于相應(yīng)的對(duì)照組，但基本未形成顯著性差異，與白細(xì)胞的小浮動(dòng)變化相似，這樣的結(jié)果符合已報(bào)道的溶菌酶的活性變化與循環(huán)系統(tǒng)中白細(xì)胞數(shù)目變化相一致［21］。且值得注意的是，方一給藥的實(shí)驗(yàn)組在熱刺激后各組織中溶菌酶活性下降較少，表現(xiàn)出較強(qiáng)的應(yīng)答反應(yīng)。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)選取的中藥方劑對(duì)施氏鱘血清中蛋白含量，白細(xì)胞吞噬能力及各組織中溶菌酶活性均有一定的提高和促進(jìn)作用。貫眾及方二對(duì)于魚(yú)血清中各種蛋白含量提高及白細(xì)胞吞噬活性有較好的促進(jìn)和增強(qiáng)作用，而方一在促進(jìn)魚(yú)體對(duì)高溫刺激做出高效應(yīng)答、提高魚(yú)體應(yīng)急情況下的免疫調(diào)節(jié)有較好的作用。

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