劉蓮蓮，張應(yīng)龍，楊?，摚R衛(wèi)明 ，曹永芝

(1.山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250103;2.國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250103;3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 泰安 271018)

當(dāng)前對(duì)大腸桿菌病的治療主要以抗生素為主，然而近年來(lái)由于抗生素濫用，耐藥菌株不斷出現(xiàn)，常用治療藥物的療效越來(lái)越差，通過(guò)研究不同治療條件下大腸桿菌對(duì)仔兔腸道顯微結(jié)構(gòu)的影響，比較常用抗生素慶大霉素和生物活性物質(zhì)乳酸菌素的治療效果，對(duì)獸醫(yī)臨床提供理論支撐，對(duì)研究大腸桿菌的致病機(jī)理有重要作用。兔大腸桿菌病又稱粘液性腸炎，是由致病性大腸桿菌及其產(chǎn)生的毒素引起的一種暴發(fā)性腸道性疾病［1］，以斷奶后不久的幼兔多發(fā)，且病程長(zhǎng)、反復(fù)發(fā)作、死亡率高。佟承剛等［2］對(duì)腹瀉病死兔檢驗(yàn)結(jié)果表明，以大腸桿菌為病因的占首位，大腸桿菌一般分為腸毒性大腸桿菌(ETEC)、非腸毒性大腸桿菌(EPEC)和侵襲性大腸桿菌(EIEC)。國(guó)內(nèi)外研究表明，只有非腸毒性大腸桿菌所致的家兔腸炎是最重要的［3－10］。絨毛和微絨毛是小腸最具特征性的結(jié)構(gòu)，是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)吸收的重要場(chǎng)所。小腸的絨毛長(zhǎng)度、黏膜厚度、絨毛表面積都是衡量小腸消化吸收功能的重要指標(biāo)［11］。絨毛長(zhǎng)度、黏膜厚度增加可使小腸吸收面積擴(kuò)大，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收［12，13］。絨毛和隱窩深度的比值常?？梢哉f(shuō)明腸上皮細(xì)胞更新代謝的程度。兔小腸絨毛長(zhǎng)度隨著日齡的增加而增大，腺窩深度增加，大腸桿菌等應(yīng)急可使腸絨毛變短［14］。Peeters等［15］對(duì)比利時(shí)和荷蘭養(yǎng)兔場(chǎng)調(diào)查表明，21個(gè)兔場(chǎng)中的70%存在能粘附腸上皮并破壞微絨毛的大腸桿菌。腸黏膜屏障是由腸黏膜上皮細(xì)胞、腸黏液層、腸黏膜免疫系統(tǒng)、腸道正常微生物群等環(huán)節(jié)組成的復(fù)雜的防御系統(tǒng)，在阻止病原微生物入侵方面有非常重要的作用。腸黏膜上皮細(xì)胞層則是機(jī)體與內(nèi)外環(huán)境之間的第一道屏障［16］。它是將宿主的結(jié)締組織和外界環(huán)境隔離開(kāi)的物理屏障。阻擋細(xì)胞旁路運(yùn)輸?shù)募?xì)胞緊密連接和富含肌動(dòng)蛋白的微絨毛相結(jié)合在上皮細(xì)胞的頂部可以抵擋外界微生物附著和入侵。作為一個(gè)選擇性通透屏障，上皮細(xì)胞允許營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、電解質(zhì)和水的通過(guò)，而對(duì)腸內(nèi)的毒素和抗原則保持著一種有效的抵抗。各種原因引起腹瀉的共同特點(diǎn)是造成腸道粘膜上皮的損傷，腸道粘膜上皮的損傷和修復(fù)是腹瀉發(fā)生的中心環(huán)節(jié)［17］。鮑國(guó)連［18］等對(duì)該病引起兔體的理化參數(shù)變化及病理特性進(jìn)行了深入研究，但對(duì)該病引起腸道顯微結(jié)構(gòu)的研究國(guó)內(nèi)相對(duì)較少，本研究利用致病性大腸桿菌通過(guò)腹腔注射感染家兔，觀察不同治療條件下兔腹瀉過(guò)程中臨床癥狀、大體剖檢變化、病理組織學(xué)變化以及超微結(jié)構(gòu)的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30～40日齡健康新西蘭兔，購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司(合格證號(hào):0008991，許可證號(hào):scxl魯20080002)。

1.1.2 大腸桿菌 (CICC編號(hào):23657)，由濟(jì)南出入境檢驗(yàn)檢疫局提供。

1.1.3 大腸桿菌懸液的制備 將大腸桿菌接種于高壓滅菌的肉湯中，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)28 h，活菌數(shù)達(dá)到2×109個(gè)/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物處理及分組 40只30～40日齡新西蘭兔，體質(zhì)量為750～1000 g，室溫22～24℃飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水，光照周期為12 h/12 h，飼養(yǎng)環(huán)境安靜，通風(fēng)良好。預(yù)飼1周后隨機(jī)分為4組，每組10只，第1組為正常對(duì)照組(G1)，于試驗(yàn)當(dāng)天腹腔注射生理鹽水2mL;第2組為大腸桿菌感染組(G2)，腹腔注射大腸桿菌培養(yǎng)液2mL;第3組為慶大霉素治療組(G3)，腹腔注射大腸桿菌培養(yǎng)液2mL，出現(xiàn)癥狀后(注射菌液后第2天)肌注慶大霉素0.5mL(2萬(wàn)U/mL)∕只，連續(xù)注射3 d;第4組為乳酸菌素治療組(G4)，腹腔注射大腸桿菌培養(yǎng)液2mL，出現(xiàn)癥狀后(注射菌液后第2天)口服乳酸菌素1片(400 mg/片)，連續(xù)3 d。每日觀察家兔的臨床癥狀，人工感染后1、3、5 d各組隨機(jī)選取3只家兔剖檢，記錄剖檢變化。

1.2.2 腸道的光鏡觀察 取上述1.2.1剖檢家兔的腸管組織用4%的多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色后，光鏡觀察其組織病理學(xué)變化。

1.2.3 腸道超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察 取試驗(yàn)1.2.1剖檢家兔空腸0.5 cm，生理鹽水漂洗干凈后立即放入2.5%的戊二醛中固定，PBS洗滌，1%鋨酸后固定，梯度乙醇及純乙酸乙酯脫水，臨界點(diǎn)干燥，噴金鍍膜后置掃描電鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 家兔臨床癥狀的變化

圖1 感染后第3天腸粘膜顯微結(jié)構(gòu)的變化Fig.1 The changes of intestine microstructure on the third day after infection

大腸桿菌感染組(G2)兔注入大腸桿菌后第1天精神沉郁，出現(xiàn)腹瀉癥狀;第2天食欲減退或廢絕，糞便粒細(xì)小、兩頭尖、成串、外有透明樣黏液;第3天有2只死亡，水瀉、糞便呈黃色或棕色，肛門附近及后腳被稀糞污染;第4天精神有所好轉(zhuǎn)，飲食量逐漸增加;第5天腹瀉癥狀減輕，家兔活動(dòng)量和飲食量有所增加，第7天家兔精神良好，腹瀉癥狀消失，飲食量和活動(dòng)量基本正常。慶大霉素治療組(G3)于第2天和出現(xiàn)明顯臨床癥狀，第5天基本恢復(fù)正常，未見(jiàn)死亡。乳酸菌素治療組(G4)第2天開(kāi)始出現(xiàn)明顯癥狀，第7天基本恢復(fù)正常。對(duì)照組未出現(xiàn)腹瀉癥狀和其他臨床癥狀。

2.2 腹瀉家兔的剖檢變化

大腸桿菌感染組(G2)兔第1天肝臟、腎臟、脾臟稍有腫大，胃底部粘膜充血，十二指腸、空腸、結(jié)腸和盲腸粘膜均有不同程度的充血、出血、水腫、腸壁變薄、膀胱充盈;第3天胃膨脹，回腸內(nèi)容物呈膠樣，結(jié)腸有透明淡黃色膠樣黏液，肝臟呈暗褐色，有出血點(diǎn)，嚴(yán)重者腸壁呈半透明狀，腸管內(nèi)充滿黃色或褐色的稀薄內(nèi)容物;第5天剖檢變化減輕。有個(gè)別兔出現(xiàn)纖維素性肝周炎。與大腸桿菌感染組相比，慶大霉素治療組(G3)和乳酸菌素治療組(G4)剖檢變化明顯減輕，第5天基本正常，對(duì)照組剖檢未見(jiàn)異常。

2.3 家兔病理組織學(xué)的變化

大腸桿菌感染組(G2)第1天空腸絨毛出現(xiàn)萎縮、脫落，杯狀細(xì)胞數(shù)量增多;第3天空腸絨毛出現(xiàn)明顯萎縮、斷裂、脫落，損傷較為嚴(yán)重(圖1);第5天腸道損傷減輕。與G2組相比，G3和G4組第3天空腸絨毛損傷減輕(圖1);第5天腸道萎縮程度明顯減輕，空腸絨毛的形態(tài)和排列趨于正常。對(duì)照組腸道組織結(jié)構(gòu)正常、絨毛排列整齊、腸腺輪廓清晰。

2.4 家兔腸道超微結(jié)構(gòu)的變化

圖2 感染后第3天腸道粘膜超微變化Fig.2 The changes of intestine ultrastructure on the third day after infection

大腸桿菌感染組(G2)感染第3天空腸絨毛頂端出現(xiàn)萎縮、脫落(圖2)，微絨毛脫落，排列雜亂稀疏、紊亂(圖3)，部分上皮細(xì)胞脫落(圖4)。

與G2組相比，G3和G4組第3天空腸絨毛頂端和微絨毛的脫落現(xiàn)象減輕，損傷輕微。對(duì)照組空腸絨毛排列整齊，微絨毛分布均勻致密，排列整齊。

3 結(jié)論與討論

徐倩倩等［19］研究了白頭翁素對(duì)PRV(輪狀病毒)、E.coli(大腸桿菌)混合感染性小鼠腹瀉腸道超微結(jié)構(gòu)的影響，表明白頭翁素對(duì)輪狀病毒和大腸桿菌混合感染性腹瀉具有顯著防治功效的機(jī)制與其抵抗腸道粘膜損傷并加速粘膜修復(fù)有關(guān)，本研究表明兔引發(fā)大腸桿菌病時(shí)，生物活性物質(zhì)乳酸菌素的治療機(jī)制也與微結(jié)構(gòu)修復(fù)有關(guān)，與小鼠作用機(jī)理相同。2種藥物對(duì)兔大腸桿菌均有有效的治療作用，并且在疾病恢復(fù)期乳酸菌素的治療效果優(yōu)于慶大霉素，所以當(dāng)仔兔發(fā)生大腸桿菌病時(shí)，可以嘗試使用生物活性物質(zhì)，以有利于小腸絨毛、微絨毛和上皮細(xì)胞的恢復(fù)。通過(guò)超微結(jié)構(gòu)的觀察，課題組下一步將討論不同的治療條件對(duì)腸道小腸黏膜免疫的影響，該研究對(duì)后續(xù)研究有重要意義。

圖3 感染第3天微絨毛超微變化Fig.3 The changes of Microvilli ultrastructure on the third day after infection

圖4 感染后腸道上皮細(xì)胞的超微變化Fig.4 The changes of Intestinal epithelial cells ultrastructure after infection

小腸的正常結(jié)構(gòu)與功能是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被充分消化與吸收的基本保證，特別是小腸的腸粘膜厚度、絨毛長(zhǎng)度、隱窩深度及絨毛表面積是衡量小腸消化吸收功能的重要指標(biāo)［20，21］，腸絨毛長(zhǎng)度與細(xì)胞數(shù)量呈顯著相關(guān)，絨毛短時(shí)，成熟的絨毛細(xì)胞減少，對(duì)養(yǎng)分的吸收能力降低。兔小腸絨毛在病理狀態(tài)下的變化表明，大腸桿菌引起的腹瀉對(duì)小腸正常組織的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損害，引起酶水平和吸收能力的下降。隨著腸絨毛長(zhǎng)度和粘膜厚度的恢復(fù)，病兔逐漸恢復(fù)正常［22］。從不同實(shí)驗(yàn)組之間的臨床癥狀、大體剖檢變化、病理組織學(xué)變化以及超微結(jié)構(gòu)變化的差異說(shuō)明慶大霉素和乳酸菌素對(duì)于大腸桿菌引起的腹瀉治療作用明顯，在疾病恢復(fù)期乳酸菌素的治療效果好于慶大霉素，所以生物活性物質(zhì)乳酸菌素對(duì)大腸桿菌引起的腹瀉有較好的治療作用，微生態(tài)制劑等其他生物活性物質(zhì)對(duì)大腸桿菌引起的腹瀉是否優(yōu)于乳酸菌素有待于進(jìn)一步研究。

緊密連接是腸黏膜屏障的重要組成部分，它可以控制大分子水溶性物質(zhì)在腸上皮細(xì)胞中的自由進(jìn)出。庾慶華等［23］通過(guò)大腸桿菌K88感染體外培養(yǎng)的Caco－2細(xì)胞單層模型和大鼠灌胃實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞間的連接變得松散，Occludin、Claudin－1、Zo－1、E－cadherin的分布變得紊亂、表達(dá)量下降，使緊密、粘附連接遭到破壞。Zhang等［24］發(fā)現(xiàn)隨著病原性大腸桿菌的感染，緊密連接結(jié)構(gòu)受到損傷，緊密連接形態(tài)的改變伴隨著細(xì)胞旁通路的滲透性增加，導(dǎo)致緊密連接屏障功能的損壞。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)感染大腸桿菌后不同時(shí)期腸道超微結(jié)構(gòu)變化發(fā)現(xiàn)與上述結(jié)果一致。通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，感染大腸桿菌后，部分上皮細(xì)胞脫落，且上皮細(xì)胞表面的微絨毛也發(fā)生大面積脫落現(xiàn)象，腸道損傷較為嚴(yán)重。杯狀細(xì)胞分泌的粘液糖蛋白可與病原微生物競(jìng)爭(zhēng)抑制腸上皮細(xì)胞上的粘附素受體，抑制病菌在腸道的粘附定植［25］，但由于上皮細(xì)胞損傷較嚴(yán)重，這一抑制病菌在腸道粘附定值的作用大大減弱。微絨毛是細(xì)胞表面的細(xì)長(zhǎng)指狀突起，廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞表面，是小腸柱狀上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜向腸腔方向形成的突起，呈細(xì)長(zhǎng)的圓筒狀，小腸上的微絨毛使細(xì)胞的表面積擴(kuò)大了30倍，大大有利于大量的吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不論微絨毛的長(zhǎng)度還是數(shù)量，都與細(xì)胞的代謝強(qiáng)度有著相應(yīng)的關(guān)系。大腸桿菌其致病性主要依靠其緊密地粘附于腸上皮細(xì)胞，導(dǎo)致微絨毛的損傷和柱狀上皮細(xì)胞損害，造成細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，引起腸道炎癥和腹瀉、血液中白細(xì)胞增多，有大量炎性細(xì)胞侵害實(shí)質(zhì)臟器和消化道。毒素和有害物質(zhì)被吸收后，改變了腸道通透性，導(dǎo)致電解質(zhì)從血液中滲入消化道［26］。微絨毛的脫落使細(xì)胞與外環(huán)境的物質(zhì)交換能力減弱，不利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，細(xì)胞代謝強(qiáng)度減弱，大腸桿菌引起的腹瀉與絨毛、微絨毛和上皮細(xì)胞等結(jié)構(gòu)損傷與修復(fù)有關(guān)，而乳酸菌素有利于增強(qiáng)其修復(fù)功能。乳酸菌素對(duì)大腸桿菌引起的局部黏膜免疫是否有增強(qiáng)作用，有待于進(jìn)一步研究。

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