霍俊宏，武艷平，謝金防，萬明春，韋啟鵬，儲(chǔ)怡士，周泉勇

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200)

我國是世界上動(dòng)物遺傳資源最為豐富的國家之一，在國際上占有重要地位［1］。江西省豬種遺傳資源十分豐富，現(xiàn)有地方豬品種8個(gè)，分別為玉山黑豬、修水杭豬、樂平花豬、贛西兩頭烏豬、贛中南花豬、贛東黑豬、濱湖黑豬和東鄉(xiāng)花豬，保持地方豬抗逆性強(qiáng)，肉質(zhì)鮮美的特點(diǎn)，遺傳多樣性也較豐富。但是，由于外來品種引入雜交來改善地方豬種瘦肉率低和生長(zhǎng)較慢，使得地方豬種數(shù)量逐漸減少。

遺傳多樣性保護(hù)一般考慮兩方面:品種內(nèi)遺傳多樣性和品種間遺傳多樣性。品種的滅絕嚴(yán)重威脅著家畜的遺傳多樣性，畜禽種質(zhì)所攜帶的優(yōu)良基因丟失，導(dǎo)致這種資源的永遠(yuǎn)消失和無法挽回。由于受市場(chǎng)需求引起的豬品種不均衡利用，導(dǎo)致江西省地方豬品種數(shù)量處于瀕危邊緣，按FAO家畜品種的損害程度等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)來看，有1個(gè)豬種瀕臨絕種，有4個(gè)豬種屬于瀕危范圍，有2個(gè)豬種屬脆弱范圍，有1個(gè)屬危險(xiǎn)范圍，致使江西的地方豬種保種已面臨十分嚴(yán)重的危機(jī)。為了經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展、保留人類文化以及將來的科學(xué)研究，保護(hù)地方豬品種的工作勢(shì)在必行［2］。

本文對(duì)江西地方豬的mtDNA D－loop高變區(qū)序列進(jìn)行分析，旨在探討豬品種的遺傳多樣性，為江西地方豬品種的保存和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 豬耳組織樣的采集

本試驗(yàn)共采集8個(gè)江西地方豬品種的383份耳組織樣品，分別采自江西省的不同縣，詳見表1。采集耳組織樣放入含有70%酒精的離心管中，凍存于－86℃冰箱中以備用。

表1 地方豬品種多樣性分析Tab.1 Location of pig breeds and their diversity

1.2 基因組DNA的提取

基因組DNA的提取采用常規(guī)的酚抽提法［3］，8 g/L的凝膠電泳檢測(cè)，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR試驗(yàn)所用的引物

PCR擴(kuò)增引物由Invitrogen公司合成，引物序列:5＇TATTCCCTGTCCATTCGT 3＇和5＇GCTGAGTCTAAGCATCCC 3＇。PCR 擴(kuò)增體系為 25μL，TaqDNA 聚合酶 0.2μL(3.0 U/μL)10×buffer 2.5μL 、dNTPs1.5μL、引物2μL、DNA 模板 1μL，蒸餾水補(bǔ)齊 25μL。擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性4min，94 ℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，經(jīng)32個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

從Genbank獲取歐洲和日本野豬序列(AB015094-AB015096，AB015087-AB015090)7條，分別用BioEdit7.0、MEGA3.0軟件進(jìn)行多重比對(duì)［4］和進(jìn)化分析［5］。數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換、分子差異等級(jí)分析等分別用DnaSP4.0［6］和 ARLEQUIN 3.0 統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算獲得［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)8個(gè)江西地方豬DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段見圖1。

2.2 線粒體D-loop高變區(qū)序列多態(tài)性分析

對(duì)8個(gè)地方豬品種153條截取的515 bp進(jìn)行了多態(tài)性分析，單倍型多樣性值從修水杭豬的0.338±0.120到玉山黑豬的 0.819±0.064，堿基多樣性從贛中南花豬的0.0008±0.0005到玉山黑豬的0.0079±0.0066(表1)。單倍型總數(shù)為35個(gè)，變異位點(diǎn)20個(gè)，各品種堿基含量差異不大。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 The results of PCR amplification fragment

表2 AMOVA分析Tab.2 The hierarchical components under AMOVA framework

2.3 利用D-loop高變區(qū)序列進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析

對(duì)8個(gè)地方豬品種153條序列進(jìn)行AMOVA分析，線粒體DNA的D－loop高變區(qū)品種間的方差組分只占總變異的37.73%，品種內(nèi)的方差組分占62.27%，F(xiàn)ST=0.38，經(jīng)檢驗(yàn)差異不顯著(P＜0.05)，見表2。

2.4 高變區(qū)序列歧點(diǎn)分布及網(wǎng)絡(luò)分析

利用network軟件對(duì)所有樣本進(jìn)行分析，圖2的星狀圖表明群體經(jīng)歷過群體擴(kuò)張。圖3的歧點(diǎn)分布呈1個(gè)倒鐘形的單峰分布，也進(jìn)一步驗(yàn)證了群體擴(kuò)張事件。中性檢驗(yàn)值Tajima’S D和Fs檢驗(yàn)，其中 D=－0.975、Fst=－13.439，都是負(fù)值，經(jīng)檢驗(yàn)差異顯著，表明江西地方豬品種曾經(jīng)過群體擴(kuò)張事件。

圖2 樣本中介網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Median－joining(MJ)network Circle size represents

圖3 歧點(diǎn)分布分析，F(xiàn)ig.3 Mismatch distribution constructed using sequences collected in the study.

3 討論

以前對(duì)家豬的起源有好多報(bào)道，Larson等［8］研究表明野豬是現(xiàn)代家豬的主要起源，家豬的馴化地并不是局限于近東和遠(yuǎn)東地區(qū)，也分布于歐洲和歐亞大陸地區(qū)，Luetkemeier等［9］研究結(jié)果表明亞洲馴化群體來源于多個(gè)亞洲中心起源。Souza等［10］通過分析線粒體細(xì)胞色素b基因表明本地主要豬品種起源2個(gè)不同的歐洲母系支系。Chang等［11］利用19個(gè)微衛(wèi)星DNA分析了臺(tái)灣本地豬的遺傳變異和系統(tǒng)進(jìn)化，并分析了本地豬和外來豬種的遺傳滲入，結(jié)果表明家豬核遺傳變異和系統(tǒng)進(jìn)化信息對(duì)將來本地豬的保存和群體管理是很有價(jià)值的。中國對(duì)豬僅次于狗被馴化，我國家豬是在不同地域被各自馴化當(dāng)?shù)匾柏i而成的。Lan等［12］通過對(duì)中國西南部地方品種豬的mtDNA的RFLP研究，認(rèn)為這些地方品種可能起源于西南部的野豬。同樣，Huang等［13］也提出了中國的地方品種豬起源于某一個(gè)品種的觀點(diǎn)。在浙江余姚河姆渡遺址和江西萬年仙人洞遺址發(fā)現(xiàn)的家豬遺骨和陶豬，距今已有7000年歷史［14］。可見，江西及周邊地區(qū)在家豬馴化方面具有不可忽視的地位。

本文應(yīng)用mtDNA D－loop高變區(qū)分析江西地方豬的遺傳多樣性，探討品種的起源和品種間的遺傳分化關(guān)系，對(duì)8個(gè)江西地方豬品種153條截取的515 bp進(jìn)行了多態(tài)性分析，單倍型多樣性值從修水杭豬的0.338 ±0.120 到玉山黑豬的0.819 ±0.064，堿基多樣度從贛中南花豬的0.0008 ±0.0005 到玉山黑豬的0.0079±0.0066，可以看出玉山黑豬有較高的遺傳多樣性，為玉山黑豬基因庫的保存提供理論依據(jù)。轉(zhuǎn)換與顛換的比率為34∶1表示轉(zhuǎn)換的頻率遠(yuǎn)高于顛換，是由于顛換要求磷脂的親水頭從一側(cè)穿過脂溶性的磷脂分子層到另一側(cè)，這樣比較困難，而轉(zhuǎn)換只是親水頭在一側(cè)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)，所以在物種進(jìn)化中更多是轉(zhuǎn)換。對(duì)所有樣本進(jìn)行分子差異等級(jí)分析(AMOVA)，品種間的方差組分只占線粒體DNA的D－loop高變區(qū)序列總變異的37.73%，品種內(nèi)的方差組分占62.27%，F(xiàn)st=0.38，經(jīng)檢驗(yàn)差異不顯著(P＜0.05)，見表2，品種內(nèi)方差大于品種間方差，表明這些地方豬品種間遺傳分化還不明顯，品種間表現(xiàn)較弱的遺傳結(jié)構(gòu)，可能豬是人類生活的必需品，隨人們生活遷徙而在不同地方遷移，在一定程度上也反映了人類遷徙的歷史。對(duì)153條序列進(jìn)行了歧點(diǎn)分布分析，呈1個(gè)倒鐘形的單峰分布，表明整個(gè)群體經(jīng)過1次群體擴(kuò)張。通過對(duì)地方豬遺傳多樣性研究，為品種的保存以及品種的選育利用提供基礎(chǔ)資料。

［1］盛志廉.論保護(hù)家畜多樣性［M］//陳瑤生，潘玉春.中國家畜遺傳資源保護(hù)與利用——盛志廉先生80壽辰紀(jì)念文集.北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2003.

［2］羅明.地方豬種遺傳資源保護(hù)和利用［J］.豬業(yè)科學(xué)，2008(8):100－102.

［3］Sambrook J，Russell D W.Molecular Cloning:A Laboratory Manual［M］.3rd ed.New York:Cold Spring Harbor Lab Press，2000.

［4］Hall T A.BioEdit:a user－ friendly biological sequence alignment editor and analysis program for windows 95/98/NT［J］.Nucleic Acids Symposium Series，1999，41:95 －98.

［5］Kumar S，Tamura K，Nei M.MEGA3:Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment［J］.Briefings of Bioinformatics ，2004(5):150－163.

［6］Rogers A R，Harpending H.Population growth makes waves in the distribution of pairwise genetic differences［J］.Molecular Biology and Evolution，1992，9:552 －569.

［7］Excoffier LGL，Schneider S.Arlequin ver.3.0:an integrated software package for population genetics data analysis［J］.Evolutionary Bioinformatics Online，2005(1):47 －50.

［8］Larson G，Dobney K，Albarella U，et al.Worldwide phylogeography of wild boar reveals multiple centers of pig domestication［J］.Science，2005，307(5715):1618 －1621.

［9］Luetkemeier E S，Sodhi M，Schook L B，et al.Multiple Asian pig origins revealed through genomic analyses［J］.Molecular phylogenetics Evolution，2010 ，54(3):680 －686.

［10］Souza C A，Paiva S R，Pereira R W，et al.Iberian origin of Brazilian local pig breeds based on Cytochrome b(MT－CYB)sequence［J］.Animal Genetic.2009，40(5):759 －762.

［11］Chang W H，Chu H P，Jiang Y N，et al.Genetic variation and phylogenetics of Lanyu and exotic pig breeds in Taiwan analyzed by nineteen microsatellite markers［J］.J Anim Sci，2009，87(1):1 －8.

［12］Lan H ，Shi L.The origin and genetic differentiation of native breeds of pigs in southwest China:an approach f rom mitochondrial DNA polymorphism.Biochemical Genetics［J］.1993，31(122):512 －560.

［13］Huan G Y，Shi X，Zhang Y.Mitochondrial genetic variation in Chinese pigs and wild boars［J］.Biochemical Genetics，1999，37:335－343.

［14］黃英偉，尹北直.中國新石器時(shí)期家豬的馴養(yǎng)和分布情況［J］.文物春秋，2006(6):7－10.