鄔秀娣，張　振，陳　勇，干敏芝，黃嫻倩，謝斌華

(浙江省寧波市第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，寧波 315010)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的全身性慢性自身免疫性疾病，多發(fā)于青壯年，我國(guó)發(fā)生率為0.24%～0.5%，累及數(shù)百萬人。貧血為RA中最常見的關(guān)節(jié)外癥狀之一，文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)生率在30%～60%不等。合并嚴(yán)重貧血是加重患者全身癥狀及關(guān)節(jié)功能障礙、影響預(yù)后的重要因素[1]。鐵調(diào)素(hepcidin，Hepc)是由肝細(xì)胞分泌的小分子多肽，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵代謝平衡的關(guān)鍵因子。Hepc通過調(diào)節(jié)腸道鐵吸收及調(diào)控巨噬細(xì)胞內(nèi)鐵的釋放，調(diào)節(jié)鐵代謝。研究表明，Hepc不僅是導(dǎo)致慢性炎性貧血的潛在因素，同時(shí)還具有鐵調(diào)節(jié)功能外的其他功能，其可能通過免疫調(diào)節(jié)作用直接參與了慢性炎性疾病的發(fā)病機(jī)制[2]。為進(jìn)一步了解Hepc在RA中的作用及其與貧血的關(guān)系開展本研究，以期為臨床提供參考。

對(duì)象和方法

病例收集及分組

選擇2011年10月至2012年6月在浙江省寧波市第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院的且有完整資料的患者作為RA組，診斷均符合 2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(American College Of Rheumatology，ACR)歐洲風(fēng)濕病防治聯(lián)合會(huì)(European League Against Rheumatism，EULAR)RA的分類標(biāo)準(zhǔn)[3]。RA組中血清Hepc水平>5.86 ngml者納入Hepc升高組，Hepc水平≤5.86 ngml者納入Hepc正常組。其他系統(tǒng)性結(jié)締組織病(connective tissue disease，CTD)對(duì)照組(其他CTD組)20例，診斷均符合相應(yīng)的分類診斷標(biāo)準(zhǔn)。健康對(duì)照組20例，均選自同期在我院健康體檢中心常規(guī)體檢的健康志愿者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并除自身免疫性疾病及其繼發(fā)疾病外的其他系統(tǒng)原發(fā)慢性疾病者，包括高血壓、糖尿??；急性感染者；乙型、丙型肝炎病毒感染；人類免疫缺陷病毒、結(jié)核等慢性感染者；惡性腫瘤患者；嚴(yán)重肝腎功能異常者(血清總膽紅素、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶>2倍參考值上限；血清肌酐、尿素氮>1.5倍參考值上限)；半年內(nèi)有明確出血史、手術(shù)史或分娩史者；妊娠者；3個(gè)月內(nèi)有補(bǔ)充鐵劑治療或生物制劑治療史者；健康對(duì)照組參照個(gè)人檔案及其他檢查結(jié)果，剔除已患有急慢性疾病者、腫瘤史者、乙型及丙型肝炎病毒攜帶者，剔除合并高脂血癥、高血壓、高血糖、高尿酸血癥者。

本研究得到寧波市醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與者均知情并同意其血液用于臨床研究。

臨床資料收集

收集RA患者的臨床資料，包括性別、年齡、病程、是否合并其他疾病、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、患者自我綜合評(píng)分；收集其他CTD組患者的臨床資料，包括性別、年齡、所患疾病及其他共存疾病。收集健康志愿者的一般資料，包括年齡、性別、健康狀況。

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

所有標(biāo)本為空腹12 h以上后于次日清晨7：00～9：00抽取外周靜脈血15 ml。其中5 ml立即用于檢測(cè)紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(red blood cell，RBC)、血紅蛋白含量(hemoglobin，Hb)。另10 ml予2000轉(zhuǎn)min離心10 min后，取血清，檢測(cè)C反應(yīng)蛋白(C reaction protein，CRP)、類風(fēng)濕因子(rheumatoid factors，RF)、鐵蛋白(ferritin，F(xiàn)RN)。剩余血清置于-80°冰箱中保存，待統(tǒng)一融解后用于檢測(cè)血清Hepc、白介素(interleukin，IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)4項(xiàng)。ESR檢測(cè)采用魏氏法；血常規(guī)、CRP、RF、FRN的檢測(cè)分別使用Beckman-Coulter 公司生產(chǎn)的全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀 和Array360特定蛋白分析儀；Hepc[4]、IL-1β、IL-6及TNF-α檢測(cè)使用購自Green-gene 公司的試劑盒，采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，按照說明書步驟操作，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

評(píng)價(jià)指標(biāo)

將健康對(duì)照組血清Hepc濃度均值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差，即3.5+2.36=5.86(μgL)作為正常值高限。

疾病活動(dòng)性評(píng)估采用疾病活動(dòng)性評(píng)分(disease activity score，DAS28)評(píng)分，由關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、壓痛數(shù)、患者自我綜合評(píng)分、ESR、CRP構(gòu)成，DAS28評(píng)分≤5.1為病情非高度活動(dòng)，>5.1為病情高度活動(dòng)。

細(xì)胞因子評(píng)價(jià)指標(biāo)：IL-6、TNF-α、IL-1β。貧血評(píng)價(jià)指標(biāo)：HB、RBC、FRN；男性Hb<120 gL、女性Hb<110 gL者定義為貧血。炎性指標(biāo)：CRP、ESR。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

一般資料

RA組80例，其中男15例，女65例，平均年齡(55.6±12.3)歲。其他CTD組20例，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡9例(45%，920)、系統(tǒng)性硬化癥8例、皮肌炎3例，其中男4例，女16例，平均年齡(57.5±11.9)歲。健康對(duì)照組20例，男4例，女16例，平均年齡(54.6±11.9)歲。3組患者年齡及性別比相匹配。RA組中，貧血患者47例，占59%；疾病對(duì)照組，貧血患者5例，占25%；健康對(duì)照組，貧血者2例，占10%。

3組實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較

RA組、健康對(duì)照組和其他CTD組血清Hepc濃度分別為(9.75±10.37)μgL，(3.50±1.18)μgL，(3.41±1.08)μgL。與健康對(duì)照組和其他CTD組比較，RA組血清Hepc濃度均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別=0.007、0.005)。其他CTD組與健康對(duì)照組血清Hepc濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。RBC、Hb及FRN水平在3組間比較雖有差別，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

RA患者Hepc升高組與正常組實(shí)驗(yàn)室檢查比較

RA組80例患者中，Hepc升高組36例(45%)，Hepc正常組44例(55%)。Hepc升高組DAS28評(píng)分和IL-6濃度均高于Hepc正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。年齡、Hb、RF、TNF-α、IL-1β在兩組間均無明顯差異(均P>0.05)(表1)。

表1類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者Hepc升高組與正常組間比較

組別年齡?(歲)血紅蛋白?(g∕L)疾病活動(dòng)性評(píng)分?(分)類風(fēng)濕因子#(U∕L)白介素?6#(μg∕L)白介素?1β#(μg∕L)腫瘤壞死因子α#(μg∕L)Hepc升高組(n=36)52 93±10 73106 36±15 985 53±1 63334 06±355 81258 30±342 6518 91±74 9160 71±113 94Hepc正常組(n=44)56 56±13 26111 29±16 234 63±1 67263 24±373 39245 76±425 4721 52±73 3672 70±266 58P0 2330 3690 0330 0810 0220 9950 344

Hepc：鐵調(diào)素；*正態(tài)分布數(shù)據(jù)，t檢驗(yàn)；#非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，Mann-Whitney U檢驗(yàn)

RA貧血者與非貧血者實(shí)驗(yàn)室檢查比較

RA組中，貧血者47例，非貧血者33例。RA貧血者IL-6較非貧血者明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而TNF-α、IL-1β及Hepc在RA貧血者及非貧血者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(表2)。

RA病情高度活動(dòng)者與非高度活動(dòng)者實(shí)驗(yàn)室檢查比較

RA組內(nèi)，病情高度活動(dòng)者41例，非高度活動(dòng)者39例。病情高度活動(dòng)者Hb水平明顯低于非高度活動(dòng)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。病情高度活動(dòng)者Hepc水平較非高度活動(dòng)者升高，但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.063)。而TNF-α、IL-1β和IL-6水平，在病情高度活動(dòng)者與非高度活動(dòng)者間均無明顯差異(均P>0.05)(表3)。

RA患者Hepc與其他檢查指標(biāo)的相關(guān)性

RA組血清Hepc水平與IL-6(r=0.298)和RF(r=0.264)均存在正相關(guān)(均P<0.05)；與DAS28存在明顯正相關(guān)(r=0.359，P<0.01)；但與年齡、TNF-α、IL-1β、HB、RBC、FRN、CRP、ESR均不存在相關(guān)性(均P>0.05)(表4)。

表2　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎貧血患者與非貧血患者實(shí)驗(yàn)室檢查比較Table 2　Comparison of laboratory examination results between RA patients with anemia and without anemia

表3　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情高度活動(dòng)者與非高度活動(dòng)者實(shí)驗(yàn)室檢查比較Table 3　Comparison of laboratory examination results between RA patients with high and low DAS28 scores

表4　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者鐵調(diào)素與其他因素相關(guān)性分析Table 4　Correlation analysis of hepcidin and other factors in RA patients

討　　論

RA是高發(fā)病率的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，機(jī)制復(fù)雜，至今未完全闡明。血清Hepc是近10年發(fā)現(xiàn)的小分子多肽，是體內(nèi)鐵代謝的關(guān)鍵因子，受機(jī)體鐵的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。當(dāng)機(jī)體鐵過多時(shí)，可刺激Hepc生成，阻止腸道鐵吸收及巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞內(nèi)鐵，避免鐵超載發(fā)生；而機(jī)體缺鐵時(shí)可抑制Hepc生成，增加腸道鐵吸收，促進(jìn)巨噬細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鐵及肝臟儲(chǔ)存鐵釋放，彌補(bǔ)鐵不足[5]。研究認(rèn)為，Hepc不僅受體內(nèi)鐵水平調(diào)節(jié)，還受炎性因子調(diào)控，同時(shí)其本身也參與了炎性反應(yīng)[6]。Armitage等[7]發(fā)現(xiàn)，H1N1急性感染者Hepc水平明顯升高，提示Hepc不僅是鐵代謝調(diào)節(jié)因子，還是急性時(shí)相蛋白。在自身免疫性疾病、慢性腎病等慢性炎性疾病中均發(fā)現(xiàn)Hepc水平升高[2]。Wang等[8]在針對(duì)炎性腸病的研究中發(fā)現(xiàn)，Hepc與其發(fā)病機(jī)制及炎性反應(yīng)有關(guān)，推測(cè)其可能可作為炎性腸病的治療靶點(diǎn)。在RA患者中發(fā)現(xiàn)，Hepc水平與疾病活動(dòng)性關(guān)系密切[9-10]，但針對(duì)RA患者Hepc相關(guān)研究十分有限，檢索萬方數(shù)據(jù)庫及維普資訊，尚未見相關(guān)報(bào)道。探討Hepc在RA患者中的變化及與貧血的關(guān)系，可以探索Hepc是否參與了RA的發(fā)病機(jī)制；同時(shí)，Hepc作為急性時(shí)相蛋白，是否可以反應(yīng)RA疾病活動(dòng)性及作為治療RA的藥物作用靶點(diǎn)。

本研究表明，RA患者貧血發(fā)生率達(dá)59%，不僅比正常人群高，也比其他CTD患者貧血發(fā)生率高。RA患者貧血原因很多，鐵攝入不足、藥物影響胃腸道引起失血可致缺鐵性貧血，但少有單純性缺鐵性貧血，更多的是慢性炎性貧血或兩者兼有，體內(nèi)鐵儲(chǔ)存一般正?；蚱遊11]。本研究也顯示，RA病情高活動(dòng)者Hb較非高活動(dòng)者降低，提示疾病活動(dòng)度高會(huì)進(jìn)一步加重貧血。同時(shí)，RA組FRN與健康對(duì)照組相比無差異，提示RA患者缺鐵并不是引起貧血的主要因素。一般情況下，貧血時(shí)Hepc降低，促進(jìn)鐵吸收及細(xì)胞內(nèi)鐵釋放[5]。而本研究發(fā)現(xiàn)，RA患者Hepc水平明顯升高，且RA貧血者與非貧血者間并無明顯差異，與Hb、RBC、FRN也無關(guān)，與Hae等[10]的報(bào)道一致。提示Hepc可能作為炎性因子參與RA炎性反應(yīng)。

Nemeth等[12]發(fā)現(xiàn)，給予正常人靜脈注射IL-6后，其血清Hepc水平升高，血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度下降。Kawabata等[13]發(fā)現(xiàn)，使用抗IL-6受體抗體治療的巨大淋巴結(jié)增生癥(castleman病)患者，其血清Hepc水平明顯下降。Nemeth等[12]還發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的人類肝細(xì)胞被IL-6誘導(dǎo)后出現(xiàn)Hepc mRNA表達(dá)增加，而IL-1、TNF-α卻無此作用，故認(rèn)為Hepc的生成是由于IL-6通過STAT-3機(jī)制作用于肝細(xì)胞后刺激了Hepc mRNA高轉(zhuǎn)錄及生成，與其他細(xì)胞因子如IL-1、TNF-α等無明顯關(guān)系[14-15]。但Lee等[16]則通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提出，Hepc上調(diào)并非為IL-6誘導(dǎo)，也可以是非IL-6依賴的，IL-1、IL-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β等細(xì)胞因子均可作為炎性介質(zhì)刺激Hepc mRNA轉(zhuǎn)錄及生成。大量研究已證實(shí)，IL-6、IL-1、TNF-α等參與了RA的發(fā)病機(jī)制并在其病情活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，且均已作為藥物治療靶點(diǎn)成功應(yīng)用于臨床，如Tocilizumab(托珠單抗)[17]、Anakinra(阿那白滯素)、Etanercept(依那西普)。Hashizume和Mihara[18]也認(rèn)為，IL-6是誘導(dǎo)RA患者Hepc生成并導(dǎo)致慢性炎性貧血的主要炎性因子。本研究檢測(cè)了上述3種細(xì)胞因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，45%的RA患者血清Hepc水平異常升高，且IL-6水平和DAS28評(píng)分均明顯高于Hepc水平正常者；相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn)，Hepc水平與IL-6水平及DAS28評(píng)分呈正相關(guān)，但與TNF-α及IL-1β水平無關(guān)；同時(shí)，RA貧血者IL-6水平高于非貧血者，而TNF-α及IL-1β在兩組間無明顯差異。上述結(jié)論支持了Hashizume和Mihara的觀點(diǎn)，提示RA中Hepc與IL-1、TNF-α無明顯關(guān)聯(lián)，而與IL-6及病情活動(dòng)度關(guān)系密切。推測(cè)IL-6在RA中可能作為Hepc主要誘導(dǎo)刺激因子，RA疾病活動(dòng)時(shí)，IL-6水平升高，誘導(dǎo)Hepc生成，共同參與炎性反應(yīng)，導(dǎo)致鐵吸收及利用障礙，引起或加重RA患者貧血。但本研究在病情活動(dòng)度分析中未發(fā)現(xiàn)IL-6的差異，考慮可能跟樣本量小及所采用的Mann-Whitney U檢驗(yàn)敏感度較低有關(guān)。

Koca等[19]發(fā)現(xiàn)，RA患者Hepc水平比系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者明顯升高，而系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者并未發(fā)現(xiàn)Hepc升高。本研究發(fā)現(xiàn)，Hepc水平在其他CTD組與健康對(duì)照組間無差異；其他CTD組中，45%的患者為系統(tǒng)性紅斑狼瘡，這在一定程度上也支持了Koca等[19]的結(jié)論。所以，推測(cè)Hepc異常升高可能在RA患者中更明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，Hepc水平與RF成正相關(guān)。一般并不認(rèn)為RF水平代表RA病情活動(dòng)度，但高滴度RF常與關(guān)節(jié)破壞及不良預(yù)后有關(guān)。且已有研究證實(shí)，貧血是影響RA預(yù)后的因素之一[1]。RA患者高水平的Hepc可能正是引起或加重貧血的原因之一，故提示RA患者Hepc水平可能可作為評(píng)估預(yù)后的指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)，Hepc和DAS28評(píng)分及IL-6水平相關(guān)，這與Abdel等[9]的研究一致，提示Hepc水平可能也可作為病情活動(dòng)度評(píng)價(jià)指標(biāo)。

總之，RA患者貧血發(fā)生率高，而Hepc水平明顯升高，推測(cè)Hepc不僅是RA鐵代謝調(diào)節(jié)因子，更主要的是作為炎性因子參與RA的炎性反應(yīng)，其水平升高與IL-6和病情活動(dòng)度密切相關(guān)，并與RF水平相關(guān)。RA患者高水平IL-6誘導(dǎo)了血清Hepc升高，導(dǎo)致鐵代謝紊亂，誘發(fā)或加重了RA患者貧血。Hepc可能可作為病情活動(dòng)度評(píng)價(jià)指標(biāo)和預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)之一；而Hepc是否可作為RA的治療靶點(diǎn)，則有待于進(jìn)一步研究。

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