謝斌華，彭　勇，陳　勇，張　順，鄔秀娣，張　振，黃嫻倩，季蘊辛，禹海航

(寧波市第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，寧波 315010)

原發(fā)性干燥綜合征(primary Sj?gren’s syndrome，pSS)是一種慢性、系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其發(fā)病率為0.5%～5%，男女比例約為1∶9，發(fā)病機制不明。國內(nèi)外研究均提示，少數(shù)pSS患者合并焦慮、抑郁等心理障礙[1-4]，且顯著高于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)患者及全部人群[2]。pSS和焦慮、抑郁等心理障礙之間是否存在聯(lián)系值得引起臨床關(guān)注。

嘌呤受體分為配體為腺苷酸的P1受體和配體主要為三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的P2受體。P2受體又分為P2X受體和P2Y受體，其中P2X受體是一類配體門控非選擇性陽離子通道嘌呤受體，目前已有7型P2X(P2X1-7)受體被克隆。相關(guān)研究證實，P2X7受體(purinergic P2X7receptor，P2X7R)可能通過ATP誘導(dǎo)促炎性細胞因子合成、凋亡、基因多態(tài)性等多重機制與自身免疫性疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡及RA等)[5-6]及焦慮、抑郁等心理障礙[7]的發(fā)病過程或病理生理相關(guān)。大量研究提示，P2X7R下游信號傳導(dǎo)與促炎性級聯(lián)反應(yīng)耦聯(lián)，P2X7R主要表達于單核巨噬細胞、淋巴細胞及腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞，并與其釋放成熟的促炎性細胞因子，如白介素(interleukin，IL)-1β及IL-6等有關(guān)[8-9]。

本研究針對pSS患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)上P2X7R的表達情況及其相關(guān)促炎性細胞因子(IL-1β、IL-6)水平進行研究，并量化評估上述指標(biāo)與pSS患者合并焦慮、抑郁等心理障礙的相關(guān)性，從而探討pSS患者PBMC上P2X7受體的表達情況及其與焦慮、抑郁的相關(guān)性。

對象和方法

研究對象

pSS組：選擇2012年1月至9月在寧波市第二醫(yī)院確診的pSS患者，診斷符合2002年修訂的干燥綜合征國際分類標(biāo)準(zhǔn)，且排除其他潛在的自身免疫疾病、感染、惡性腫瘤等疾病。

陽性對照：選取同時期同醫(yī)院確診的未合并干燥綜合征的RA患者作為RA組，以及同時期寧波市康寧醫(yī)院神經(jīng)癥科確診的、排除自身免疫性疾病的、焦慮和(或)抑郁患者作為焦慮抑郁組。

陰性對照：選取寧波市第二醫(yī)院健康職工(包括退休職工)20名為健康組。

所有化驗樣本的取得都事先取得了受試者的同意。

心理評估量表

漢密爾頓抑郁量表和焦慮量表用于評估受試對象是否存在焦慮和(或)抑郁及其程度。評定時間范圍設(shè)為過去1周內(nèi)。由2名經(jīng)培訓(xùn)的醫(yī)師采用交談與觀察的方式進行檢查，結(jié)束后2名評定者分別獨立評分后取均值。漢密爾頓抑郁量表超過17分評定為抑郁，小于7分為無抑郁癥狀；焦慮量表總分超過14分評定為焦慮，小于6分為無焦慮癥狀。

PBMC分離

抽取受試者空腹靜脈血(約3ml)于肝素抗凝的真空采血管中，用Ficoll-hypague(GE，USA)密度梯度離心法分離收集PBMC，并在Hanks平衡鹽液(Hyclone，USA)中洗滌2次。用含有10%熱滅活的胎牛血清(Hyclone，USA)、2mM L-谷氨酰胺及100 Uml青霉素和100 μgml鏈霉素的RPMI-1640液(Hyclone，USA)作為完全培養(yǎng)基重懸細胞。收集得到的PBMC用于P2X7受體表達流式細胞分析。

P2X7受體表達流式細胞分析

將上述完全培養(yǎng)基重懸的PBMC(1×106ml)分成2份，在其中1份中加入3 mM ATP，均在37℃5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜，用Hanks平衡鹽液洗滌1次。用PE-耦聯(lián)的抗CD14(BD Bioscience，USA)及FITC-耦聯(lián)的抗P2X7(Sigma，USA)標(biāo)記，用PE耦聯(lián)的IgG1(BD Bioscience)及全IgG抗體(Sigma，USA)作為同型對照。細胞懸液與抗體充分混勻，4℃避光靜置30 min。Hanks平衡鹽液洗滌2次后重懸細胞。用流式細胞儀(Beckman Coulter Epics XL，USA)對上述細胞進行上樣分析。流式細胞上樣分析方案見圖1。

酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)測定IL-1β、IL-6

抽取受試者空腹靜脈血于肝素抗凝的真空采血管中，留取1 ml離心1 000g×5 min，取血漿在-20℃凍存，備測。在1.5 ml EP管中加入200 μl上述抗凝新鮮全血，加入200 μl上述RPMI-1640培養(yǎng)基，并加入100 ngml脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Sigma，USA)和3 mM ATP(Sigma，USA)，并在37℃5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。離心1 000 g×5 min，取上清液在-20℃凍存，備測。用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)檢測上述細胞培養(yǎng)上清液中的IL-1β和IL-6。采用杭州聯(lián)科生物人IL-1β和IL-6酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書操作。

統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件，連續(xù)數(shù)據(jù)根據(jù)各測量結(jié)果的離散程度決定由四分位數(shù)范圍或(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。連續(xù)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布則進行均數(shù)比較，否則采用非參數(shù)統(tǒng)計。均數(shù)比較兩個獨立樣本采用t檢驗，兩個以上獨立樣本采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗；非參數(shù)統(tǒng)計兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗，兩個以上樣本采用Kruskal-Walli檢驗。雙變量服從正態(tài)分布則采用Pearson相關(guān)分析，否則采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

一般情況

pSS組共納入31例患者，其中男2例，女29例，年齡為23～81歲，平均年齡為(52.79±13.88)歲。陽性對照組中，RA組19例，其中男3例，女16例，年齡為43～78歲，平均年齡為(61.33±10.19)歲；焦慮和或抑郁組18例，其中男2例，女16例，年齡為33～66歲，平均年齡為(51.38±8.74)歲。健康組20名，男2例，女18例，年齡為34～71歲，平均年齡為(51.36±10.63)歲。各組年齡和性別構(gòu)成差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

P2X7受體表達

pSS組、RA組、焦慮抑郁組、健康組的PBMC表面均有P2X7受體表達。ATP刺激較未刺激，僅pSS組CD14+PBMC(主要為單核細胞)表面P2X7受體表達顯著增高(t=3.647，P=0.001)；在CD14-PBMC(主要為淋巴細胞)表面，P2X7受體表達在pSS組(t=4.908，P<0.001)及焦慮抑郁組(t=3.412，P=0.003)均顯著增高(表1)。

ATP刺激后，pSS組CD14+PBMC表面P2X7受體表達顯著高于RA組(P=0.044)、焦慮抑郁組(P=0.004)及健康組(P=0.002)；在CD14-PBMC表面，pSS組P2X7受體表達較RA組(P=0.039)及陰性對照組(P<0.001)顯著增高，而與焦慮抑郁組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.126)；其余各組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)(表1)。

無論ATP是否刺激，同時存在焦慮和抑郁的pSS患者CD14-PBMC表面P2X7受體表達顯著高于無焦慮和抑郁的pSS患者(ATP刺激時P=0.003，無刺激時P=0.009)(表2)。

IL-1β及IL-6測定

PBMC培養(yǎng)上清液在無LPS及ATP刺激時，各組幾乎均未檢測出IL-1β。刺激后各組均檢測出IL-1β，在LPS和ATP刺激2 h后，pSS組IL-1β水平顯著高于RA組(Z=-2.560，P=0.010)、焦慮抑郁組(Z=-2.109，P=0.035)及陰性對照組(Z=-2.244，P=0.025)，其余各組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)(表2)。

無LPS及ATP刺激時，陰性對照組IL-6水平顯著低于pSS組(Z=-2.521，P=0.012)、RA組(Z=-3.724，P<0.001)及焦慮抑郁組(Z=-2.406，P=0.016)；RA組IL-6水平較pSS組(Z=-2.647，P=0.008)及焦慮抑郁組(Z=-2.347，P=0.019)均顯著增高；pSS組與焦慮抑郁組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-0.074，P=0.941)。LPS及ATP刺激2 h后，各組IL-6水平顯著高于未刺激前水平(Z=-6.793，P<0.001)，但刺激后各組IL-6水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.778，P=0.855)(表3)。

表1　流式細胞儀檢測外周血單個核細胞表面P2X7受體表達Table 1　Expression of P2X7 receptor on peripheral blood mononuclear cells by flow cytometry　[%，(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)]

ATP：三磷酸腺苷；pSS：原發(fā)性干燥綜合征；RA：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；a顯著高于RA組(P=0.044)、焦慮抑郁組(P=0.004)、健康組(P=0.002)；b顯著高于RA組(P=0.039)及健康組(P<0.001)，但與焦慮抑郁組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.126)；cATP刺激與無刺激CD14+P2X7表達之差；dATP刺激與無刺激CD14-P2X7表達之差；e單因素方差分析

表2　原發(fā)性干燥綜合征患者外周血單個核細胞表面P2X7受體表達Table 2　Expression of P2X7 receptor on peripheral blood mononuclear cells in patients with primary Sjogren’s syndrome　(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)

ATP：三磷酸腺苷；*單因素方差分析；NA：未測出

相關(guān)性分析

ATP刺激后，pSS組、焦慮抑郁組外周血CD14-PBMC表面P2X7受體表達與焦慮評分(r=0.344，P=0.030)及抑郁評分(r=0.319，P=0.045)呈顯著正相關(guān)；無ATP刺激，其表達僅與焦慮評分(r=0.442，P=0.045)呈顯著正相關(guān)。LPS及ATP刺激2 h后，pSS患者IL-1β水平與其在ATP刺激后外周血CD14+PBMC表面P2X7受體表達呈顯著正相關(guān)(r=0.447，P=0.025)；pSS組PBMC表面P2X7受體表達與 IL-6、紅細胞沉降率、C反應(yīng)蛋白及免疫球蛋白等疾病活動性指標(biāo)未見顯著相關(guān)性(表4)。

表3　外周血單個核細胞培養(yǎng)上清液IL-1β及IL-6水平Table 3　Peripheral blood mononuclear cells culture supernatant levels of IL-1β and IL-6　[pgml，(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；四分位數(shù)區(qū)間)]

表3　外周血單個核細胞培養(yǎng)上清液IL-1β及IL-6水平Table 3　Peripheral blood mononuclear cells culture supernatant levels of IL-1β and IL-6　[pgml，(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；四分位數(shù)區(qū)間)]

分組無LPS∕ATP刺激LPS∕ATP刺激2hIL?1βIL?6IL?1βIL?6pSS組NA2 12～9 5418 39±13 99a16 65～250 23RA組NA5 24～63 929 23±6 2563 40～183 11焦慮抑郁組NA2 39～9 339 44±5 5659 32～131 39健康組NA0 90～3 169 93±6 7712 55～329 79χ2—18 4029 7160 778Pb—<0 0010 0210 855

IL：白介素；LPS：脂多糖；ATP：三磷酸腺苷；pSS：原發(fā)性干燥綜合征；RA：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；NA：未測出；a顯著高于RA組(P=0.010)、焦慮抑郁組(P=0.035)及健康組(P=0.025)；bKruskal-Wallis檢驗

討　　論

早在1988年，國外學(xué)者的研究就表明pSS患者有明顯焦慮、抑郁等嚴重的精神癥狀[1]。隨后歐美等國的小規(guī)模研究均提示，pSS患者合并焦慮、抑郁等心理障礙的發(fā)生率明顯增高[2]。我國也有研究提示，49%的pSS患者存在焦慮，30%的pSS患者合并抑郁[3]。2009年美國Barbara等[4]的大規(guī)模研究也證實了上述研究結(jié)果。本研究采用了漢密爾頓焦慮、抑郁量表進行評價，也得到了相似結(jié)果。

本研究顯示，ATP刺激較未刺激，pSS患者外周血CD14+PBMC(單核細胞)表面P2X7受體表達顯著增高，而對于健康組，其表達的差異并無統(tǒng)計學(xué)意義；ATP刺激后，pSS患者外周血CD14+PBMC(單核細胞)表面P2X7受體表達較健康組顯著增高；進而提示，與RA患者、焦慮抑郁患者及健康人相比，pSS患者單核細胞對ATP的刺激更為敏感。在LPS存在的條件下，ATP刺激外周血后上清中IL-1β、IL-6顯著增高，提示嘌呤受體(特別是P2)可能與外周血細胞釋放成熟的促炎性細胞因子IL-1β、IL-6有關(guān)。而ATP刺激pSS患者外周血后，其上清中IL-1β水平與CD14+PBMC表面P2X7受體表達呈顯著正相關(guān)，進而提示單核細胞表面的P2X7受體可能參與了IL-1β的釋放。也就是說，ATP刺激后pSS患者除了單核細胞P2X7受體表達量增高外，其功能也增強。

表4　ATP刺激后CD14+外周血單個核細胞表面P2X7受體表達與pSS臨床參數(shù)的相關(guān)性Table 4　Correlation between the expression of P2X7 receptor on ATP stimulation CD14+ peripheral blood mononuclear cells and clinical parameters in pSS

IL：白介素；ATP：三磷酸腺苷；pSS：原發(fā)性干燥綜合征；a脂多糖及ATP刺激2 h

P2X7受體除了與免疫紊亂相關(guān)外，還與心理障礙有關(guān)。其被認為是神經(jīng)精神和免疫系統(tǒng)聯(lián)系的一個關(guān)鍵因子[7]，焦慮、抑郁等心理障礙的發(fā)病機制可能涉及P2X7受體。Basso等[11]研究提示，P2X7受體敲除的小鼠在懸尾實驗和強迫游泳實驗顯示出抗抑郁樣行為。Boucher等[12]研究表明也證實這一關(guān)點。編碼P2X7受體的P2X7基因位于染色體12q24.31，該區(qū)域是抑郁和焦慮障礙的重要遺傳區(qū)域，提示其可能與情感障礙有關(guān)[13]?；驁D譜和連鎖不平衡分析顯示，P2X7基因中Gln460Arg單核苷酸多態(tài)性有抑郁和雙相情感障礙的易感性，量化的病例對照研究也提示其與抑郁障礙相關(guān)[14]。

激活的P2X7受體所致細胞因子釋放可能參與了焦慮、抑郁等心理障礙的發(fā)生發(fā)展。一方面，一些針對細胞因子的研究提示，焦慮、抑郁等心理障礙普遍存在細胞因子紊亂。Song等[15]發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者血清IL-1β水平顯著增高，抗抑郁治療后其水平減低。Boufidou等[16]研究提示，婦女腦脊液IL-6水平與產(chǎn)后抑郁有關(guān)。大量的動物實驗也提示這一關(guān)點。促炎性細胞因子IL-1β及IL-6能夠?qū)е聞游锍霈F(xiàn)明顯的抑郁樣行為，而IL-1受體敲除的小鼠未誘導(dǎo)出焦慮樣行為[17]，IL-6敲除的小鼠亦未因應(yīng)激而導(dǎo)致抑郁樣行為[18]。另一方面，動物實驗證實，在LPS刺激下P2X7受體敲除的小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞分泌IL-1β明顯減少[19]。

本研究結(jié)果提示，與健康組相比，無論是pSS患者還是焦慮抑郁患者血漿中IL-6水平均顯著增高。在LPS存在的條件下，ATP刺激后外周血中IL-1β、IL-6顯著增高。ATP刺激較未刺激，pSS患者及焦慮抑郁患者外周血CD14-PBMC(主要為淋巴細胞)表面P2X7受體表達顯著增高。ATP刺激后，pSS患者外周血CD14-PBMC表面P2X7受體表達較RA患者及健康人顯著增高，而與焦慮抑郁患者相比其表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。無論ATP是否刺激，同時存在焦慮和抑郁的pSS患者CD14-PBMC表面P2X7受體表達顯著高于無焦慮和抑郁的pSS患者。ATP刺激后，外周血CD14-PBMC表面P2X7受體表達與焦慮、抑郁評分呈顯著正相關(guān)。無ATP刺激，其表達與焦慮評分呈顯著正相關(guān)。進而提示pSS患者及焦慮抑郁患者外周血CD14-PBMC(主要為淋巴細胞)對ATP刺激更為敏感。

P2X7受體可能通過活化后調(diào)節(jié)促炎性細胞因子、基因多態(tài)性等參與pSS患者及其合并焦慮抑郁狀態(tài)的發(fā)病機制及病理生理。這一結(jié)論提示，一方面或可通過動物實驗等檢測ATP刺激前后腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞上P2X7受體表達情況，進而研究其與焦慮、抑郁等心理障礙的相關(guān)性；另一方面或可將P2X7基因作為研究位點，分析pSS患者的基因多態(tài)性，進而研究其與合并焦慮、抑郁等心理障礙的相關(guān)性。

綜上所述，pSS和焦慮、抑郁等心理障礙存在著明顯的共病傾向。無論是pSS患者還是焦慮、抑郁等心理障礙的患者都存在免疫紊亂，而P2X7受體則被認為是神經(jīng)精神和免疫系統(tǒng)聯(lián)系的關(guān)鍵因子。P2X7受體可能涉及pSS混著及其合并焦慮、抑郁等心理障礙的發(fā)病機制或病理生理，而其中促炎性細胞因子IL-1β等可能發(fā)揮著重要作用。進一步研究其機制對于揭示pSS及其合并心理障礙的發(fā)病機制、尋找新的治療靶點都具有積極意義。

(本文圖1見封3)

[1]Angelopoulos N， Drosos AA， Kosovitsa G， et al. Personality and psychopathology in patients with primary Sj?gren’s syndrome[J]. Ter Arkh， 1988， 60：49-52.

[2]Valtysdóttir ST， Gudbj?rnsson B， Lindqvist U， et al. Anxiety and depression in patients with primary Sj?gren’s syndrome[J]. J Rheumatol， 2000， 27：165-169.

[3]王艷艷， 張繆佳， 沈友軒， 等. 47例原發(fā)性干燥綜合征患者的抑郁與焦慮情況調(diào)查[GOL]全國自身免疫性疾病專題研討會暨第十一次全國風(fēng)濕病學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編. 2006：232.http：lib.cnki.netcpfdFSBx200605001402.html.

[4]Barbara S， Simon JB， Phili PCF， et al. Primary Sj?gren’s Syndrome：health experiences and predictors of health quality among patients in the United States[J]. Health Qual Life Outcomes， 2009， 7：46-54.

[5]王美云，陶金輝，李向培，等.嘌呤受體P2X配體門控性離子通道7在初發(fā)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血淋巴細胞的表達及意義[J]. 中華風(fēng)濕病學(xué)雜志， 2013，17：46-48.

[6]Baroja-Mazo A， Pelegrín P. Modulating P2X7Receptor Signaling during Rheumatoid Arthritis： New Therapeutic Approaches for Bisphosphonates[J]. J Osteoporos， 2012， 2012：408242.

[7]Volonte C， Apolloni S， Skaper SD， et al. P2X7Receptors Channels， Pores and More[J]. CNS Neurol Disord Drug Targets， 2012， 11：705-721.

[8]Lister MF， Sharkey J， Sawatzky DA， et al. The role of the purinergic P2X7receptor in inflammation[J]. J Inflamm(Lond)， 2007，4：5.

[9]Arulkumaran N， Unwin RJ， Tam FW.A potential therapeutic role for P2X7receptor (P2X7R) antagonists in the treatment of inflammatory diseases[J].Expert Opin Investig Drugs， 2011，20：897-915.

[10] Solle M， Labasi J， Perregaux DG，et al.Altered cytokine production in mice lacking P2X(7) receptors[J].J Biol Chem， 2001，276：125-132.

[11] Basso AM， Bratcher NA， Harris RR， et al.Behavioral profile of P2X7receptor knockout mice in animal models of depression and anxiety： relevance for neuropsychiatric disorders[J]. Behav Brain Res， 2009， 198：83-90.

[12] Boucher AA， Arnold JC， Hunt GE，et al.Resilience and reduced c-Fos expression in P2X7receptor knockout mice exposed to repeated forced swim test[J]. Neuroscience， 2011，189：170-177.

[13] Erhardt A， Lucae S， Unschuld PG，et al. Association of polymorphisms in P2RX7 and CaMKKb with anxiety disorders[J]. J Affect Disord， 2007， 101：159-168.

[14] Hejjas K， Szekely A， Domotor E，et al.Association between depression and the Gln460Arg polymorphism of P2RX7 gene： a dimensional approach[J].Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet， 2009， 150B：295-299.

[15] Song C， Halbreich U， Han C，et al. Imbalance between pro- and anti-inflammatory cytokines， and between Th1 and Th2 cytokines in depressed patients： the effect of electroacupuncture or fluoxetine treatment[J]. Pharmacopsychiatry， 2009， 42：182-188.

[16] Boufidou F， Lambrinoudaki I， Argeitis J， et al. CSF and plasma cytokines at delivery and postpartum mood disturbances[J]. J Affect Disord， 2009， 115：287-292.

[17] Koo JW， Duman RS.Interleukin-1 receptor null mutant mice show decreased anxiety-like behavior and enhanced fear memory[J].Neurosci Lett， 2009， 456：39-43.

[18] Chourbaji S， Urani A， Inta I，et al. IL-6 knockout mice exhibit resistance to stress-induced development of depression-like behaviors[J]. Neurobiol Dis， 2006， 23：587-594.

[19] Mingam R， De Smedt V， Amédée T， et al. In vitro and in vivo evidence for a role of the P2X7receptor in the release of IL-1 beta in the murine brain[J]. Brain Behav Immun， 2008， 22：234-244.