季少平

（河南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河南 開封 475004）

非編碼RNA 是指那些不被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA 分子，除去那些看家RNA（如rRNA和tRNA）以及siRNA和microRNA，其調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制不同于長非編碼RNA（lncRNA），因此不在此討論之列。lncRNA 通常被認(rèn)為是那些大于200核苷酸長度，幾乎沒有可編碼大于100 氨基酸開放讀框的RNA 分子。和編碼RNA 相比，lncRNA 也經(jīng)過拼接，也有帽子結(jié)構(gòu)和多聚A 尾巴，但缺乏開放讀框，有些lncRNA 一度被稱為假基因（pseudogene）。對(duì)lncRNA的研究，使人們認(rèn)識(shí)了基因表達(dá)調(diào)控的一個(gè)新層面。

lncRNA 對(duì)生命過程的調(diào)節(jié)可能解釋了人類具有相似數(shù)量的蛋白質(zhì)編碼基因（與其他物種相比），卻具有更為復(fù)雜的生物學(xué)表型［1－2］。研究［2］顯 示，在人類轉(zhuǎn)錄的RNA中98%為lncRNA，而lncRNA的數(shù)量與物種的復(fù)雜性成正比關(guān)系。和編碼基因的轉(zhuǎn)錄相比，lncRNA的啟動(dòng)子區(qū)具有更為保守的序列［3－4］。lncRNA 主要通過表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，決定基因表達(dá)與否。由于RNA 具有較弱的催化活性，它們往往需要通過募集蛋白質(zhì)復(fù)合物（具有酶活性）對(duì)特定區(qū)域進(jìn)行修飾。lncRNA 可作為一個(gè)平臺(tái)，把兩種染色質(zhì)修飾復(fù)合物連接在一起，協(xié)同作用于目標(biāo)基因進(jìn)行表觀遺傳學(xué)修飾。以往，除了參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、RNA 拼接和蛋白質(zhì)合成的RNA（如rRNA和tRNA）外，其他lncRNA的轉(zhuǎn)錄都被認(rèn)為是基因表達(dá)的副產(chǎn)品，但近年的研究改變了人們對(duì)lncRNA的認(rèn)識(shí)，它們?cè)谏亩鄠€(gè)過程中起著重要作用。lncRNA 呈現(xiàn)序列多樣性，具有亞細(xì)胞分布特色，表現(xiàn)出組織和細(xì)胞特異性，并具有調(diào)節(jié)的時(shí)空特性。lncRNA 主要涉及轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、基因組修飾、X－染色體失活以及mRNA 降解。此外，lncRNA 還具有協(xié)助蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位、誘導(dǎo)蛋白質(zhì)構(gòu)象改變、以及細(xì)胞形態(tài)維持等作用。在生命過程中的不同階段以及不同的組織器官，共有基因組的95%得到轉(zhuǎn)錄。因此，lncRNA的數(shù)量要遠(yuǎn)大于編碼RNA的數(shù)量［5］。從堿基序列上看，lncRNA 在進(jìn)化上缺乏保守，呈多樣性，在功能上其三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)象可能更為重要。相對(duì)于小的非編碼RNA 如siRNA和microRNA，我們對(duì)lncRNA的認(rèn)識(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后。

1 長非編碼RNA 參與染色質(zhì)重塑

在高等生物，染色質(zhì)修飾（如組蛋白的甲基化、乙?；?、磷酸化和DNA 甲基化等）在時(shí)空上對(duì)于基因表達(dá)特異性非常重要，尤其在發(fā)育的不同階段，它們決定了一些基因在何時(shí)與何地表達(dá)與否。這些修飾決定了轉(zhuǎn)錄過程中蛋白質(zhì)因子（如轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄激活子和轉(zhuǎn)錄抑制子等）能否接近目標(biāo)DNA（如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子等），從而決定了目標(biāo)基因的開放與關(guān)閉。而修飾染色質(zhì)的酶復(fù)合物是廣泛表達(dá)的，但是如何特異地修飾特定的DNA 位點(diǎn)是分子生物學(xué)家所關(guān)心的，也是目前最難搞清楚的領(lǐng)域。

在研究X－ 染色體劑量補(bǔ)償效應(yīng)、等位基因失活以及同源基因表達(dá)不平等時(shí)，發(fā)現(xiàn)lncRNA 對(duì)這些復(fù)雜現(xiàn)象的調(diào)節(jié)，主要通過參與對(duì)基因組的表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)。而阻斷這些lncRNA 參與的表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)，可導(dǎo)致一系列發(fā)育障礙或疾病，可見lncRNA 在生命過程中的重要性。研究比較清楚的兩個(gè)lncRNA Air和Kcnqlot1參與了等位基因的表達(dá)失活調(diào)節(jié)，在基因組印記（genomic imprinting）中起著重要作用。它們通過與染色質(zhì)修飾復(fù)合物結(jié)合，對(duì)特定基因座位的組蛋白修飾，進(jìn)而抑制母系或父系等位基因的表達(dá)。Air首先聚集于Slc22a3基因的啟動(dòng)子區(qū)，募集甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a，介導(dǎo)組蛋白H3K9的甲基化。在小鼠，Air利用位于Igf2r基因第二個(gè)內(nèi)含子內(nèi)部的啟動(dòng)子得以轉(zhuǎn)錄，參與對(duì)來自父系Igf2r、Slc22a2和Slc22a3基因的表達(dá)抑制。而Air的截?cái)嗤蛔?，?dǎo)致G9a不能有效地聚集于Slc22a3基因的啟動(dòng)子區(qū)，進(jìn)而導(dǎo)致等位基因的同時(shí)轉(zhuǎn)錄，丟失了對(duì)父系等位基因的特異抑制［5］。

lncRNA與染色質(zhì)修飾復(fù)合物間的作用也是導(dǎo)致X－ 染色體失活的原因。目前已知，至少有7個(gè)lncRNA 參與了這一過程，其中包括Xist。在雌性動(dòng)物X 染色體的一條上，所有基因的表達(dá)都被關(guān)閉，而只有一條X 染色體的基因得以表達(dá)，這樣使得雌性動(dòng)物具有與雄性動(dòng)物一樣的X－ 連鎖的基因表達(dá)。Xist從將要失活的X 染色體上轉(zhuǎn)錄，然后與PRC2（polycomb represive complex 2）結(jié)合，使得PRC2沿X 染色體擴(kuò)散，并在PRC2的H3K27三甲基酶活性的作用下最終沉默整條染色體。Xist的轉(zhuǎn)錄也是受到另一個(gè)lncRNA rep A的誘導(dǎo)，rep A與PRC2結(jié)合并導(dǎo)致Xist啟動(dòng)子區(qū)H3K27的三甲基化而激活Xist的轉(zhuǎn)錄。rep A 轉(zhuǎn)錄于Xist的5＇端保守區(qū)且與Xist的轉(zhuǎn)錄方向一致，rep A 含有7.5個(gè)由28nt構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)序列，折疊成兩個(gè)保守的柄環(huán)結(jié)構(gòu)。在對(duì)基因組DNA 進(jìn)行的廣泛表觀遺傳學(xué)修飾分析中發(fā)現(xiàn)，組蛋白不同位點(diǎn)的甲基化對(duì)編碼和非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄具有類似的作用，但是DNA 甲基化對(duì)二者的影響不同［6］。

在介導(dǎo)染色質(zhì)重塑時(shí)，除蛋白質(zhì)可結(jié)合多種lncRNA 外，一種lncRNA 也好像可與多種蛋白質(zhì)結(jié)合。許多參與染色質(zhì)重塑、抑制基因表達(dá)的酶并沒有DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，卻有RNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可能暗示著lncRNA 在染色質(zhì)重塑中的重要性。如Kcnqlot1、Airn、Xist、HOTAIR與PRC1 或PRC2 結(jié)合，介導(dǎo)組蛋白2（H2）的第119位賴氨酸的單泛素化、組蛋白3（H3）的第27位賴氨酸的二甲基化或三甲基化。這些蛋白分子與不同lncRNA的結(jié)合，可能通過構(gòu)象的改變決定了它們對(duì)目標(biāo)基因的選擇特異性，而lncRNA 可能起著變構(gòu)誘導(dǎo)樣的作用。lncRNA與DNA 形成3 股核酸鏈雜交，利于DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3b對(duì)DNA的甲基化修飾［7］，但這種作用方式是否為普遍現(xiàn)象尚有待研究。

2 長非編碼RNA 參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)

已發(fā)現(xiàn)的lncRNA 大多涉及基因的轉(zhuǎn)錄，它們通過對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的募集與活性調(diào)節(jié)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控。lncRNA 除了通過順式作用直接調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)外，還可通過反式作用經(jīng)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)進(jìn)而影響目標(biāo)基因的表達(dá)。例如，來自HOXC的lncRNA HOTAIR 通過反式作用影響其他HOX 座位的轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)。lncRNA 可通過與RNA 聚合酶Ⅱ結(jié)合，影響整個(gè)轉(zhuǎn)錄“機(jī)器”而對(duì)大多數(shù)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響。如人類的Alu RNA和B2RNA，受到熱休克誘導(dǎo)，可與RNA 聚合酶Ⅱ結(jié)合而廣泛抑制基因的轉(zhuǎn)錄。

此外，lncRNA 本身的轉(zhuǎn)錄，也可引起相鄰基因的轉(zhuǎn)錄抑制。已知SRG1的轉(zhuǎn)錄可干擾臨近基因的轉(zhuǎn)錄元件與其啟動(dòng)子的結(jié)合，導(dǎo)致其他基因無法轉(zhuǎn)錄而受到抑制［8－9］。除了抑制基因表達(dá)外，lncRNA 也可介導(dǎo)激活基因的表達(dá)。Evf－2 能與Dlx－2協(xié)同特異地增強(qiáng)Dlx－5／6 增強(qiáng)子的活性，促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［10］。

RNA 聚合酶Ⅱ與增強(qiáng)子結(jié)合并對(duì)該區(qū)域進(jìn)行雙向轉(zhuǎn)錄，可轉(zhuǎn)錄出一種新的lncRNA 稱為eRNA，這種eRNA 在遠(yuǎn)端增強(qiáng)子的幫助下將沉默區(qū)段內(nèi)的某個(gè)特定基因“解救”出來，增加目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平［11－12］。因此，eRNA 更具有特異性，更具有用于基因治療的潛力。廣泛的研究表明，被沉默的基因啟動(dòng)子區(qū)，有大量的lncRNA－蛋白復(fù)合物覆蓋，在DNA序列上形成很大的區(qū)段。而且隨著生命過程的變化，這種覆蓋是處于一種動(dòng)態(tài)的過程。處于關(guān)閉狀態(tài)的基因可能在增強(qiáng)子的幫助下，重新被激活。增強(qiáng)子通過順式和反式作用，激活轉(zhuǎn)錄，而染色質(zhì)回折形成環(huán)形，使得距離較遠(yuǎn)的大跨度的DNA 靠近，方便增強(qiáng)子與目標(biāo)區(qū)域的直接接觸也是必要的。

3 長非編碼RNA 其他作用方式

lncRNA 在植物中的表達(dá)更為廣泛，其主要原因是應(yīng)對(duì)隨時(shí)的環(huán)境變化。在哺乳動(dòng)物，lncRNA 廣泛參與了細(xì)胞對(duì)外部刺激的應(yīng)激調(diào)節(jié)。在DNA 損傷時(shí)，一個(gè)位于基因間的受p53 誘導(dǎo)表達(dá)的lncRNA licnRNA－p21，與核蛋白K 一起介導(dǎo)廣泛的基因表達(dá)抑制［13］。其意義在于DNA 損傷后的修復(fù)最為重要，其他基因的表達(dá)多被暫停，如果DNA 能得以修復(fù)，那么細(xì)胞就得以生存。另一個(gè)DNA 損傷誘導(dǎo)表達(dá)的lncRNA gadd7可直接與TDP－43（TAR DNA 結(jié)合蛋白）結(jié)合，而阻止TDP－43與Cdk6的mRNA 結(jié)合，從而導(dǎo)致該mRNA的降解［14］。另外發(fā)現(xiàn)，一種饑餓誘導(dǎo)的lncRNA，Rncs－1 可抑制Dicer的活性，阻斷Dicer對(duì)雙鏈RNA的加工，抑制micro－RNA 對(duì)其他基因表達(dá)的調(diào)控［15］，但其意義仍不清楚。

翻譯后修飾可通過改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象而影響蛋白質(zhì)的活性。lncRNA 也可作為分子伴侶幫助蛋白質(zhì)改變構(gòu)象，而影響其活性。在DNA 損傷信號(hào)調(diào)節(jié)下轉(zhuǎn)錄的一種非編碼RNA 可通過調(diào)節(jié)一種RNA 結(jié)合蛋白TLS（Translocated in Lipo Sarcoma），使其構(gòu)象改變，從無活性變?yōu)橛谢钚裕?6］。此外，另一個(gè)lncRNA，是一個(gè)激素受體的RNA 激活子（SRA）可促進(jìn)核蛋白復(fù)合物SRC－1及相關(guān)核受體的激活，而調(diào)節(jié)激素相關(guān)基因的表達(dá)［17］。

另外，特定基因的反義轉(zhuǎn)錄形成的lncRNA，也能與正義鏈形成雙鏈RNA，經(jīng)Dicer加工后產(chǎn)生siRNA，經(jīng)RNAi降解mRNA 或抑制目標(biāo)基因的翻譯［18－19］。小核RNA 通過與RNA 聚合酶Ⅱ起作用，或調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后加工對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)。在轉(zhuǎn)錄時(shí)，一些位于被抑制座位的基因雖然沒有mRNA 轉(zhuǎn)錄，但卻可轉(zhuǎn)錄出小的非編碼RNA，并形成柄環(huán)結(jié)構(gòu)與PRC2復(fù)合物結(jié)合，參與介導(dǎo)目標(biāo)基因的抑制［20］。

lncRNA 幫助目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位。例如，一種酵母蛋白Mei2p需要與MeiRNA（一種lncRNA）結(jié)合后從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)［21］；而5S核糖體RNA 通過遮蔽轉(zhuǎn)錄因子TFIIA的核定位信號(hào)而使TFIIA留在胞質(zhì)［22］。有兩種lncRNA，MEN epsilon和MEN beta，他們與Paraspeckle（一種核內(nèi)蛋白核酸結(jié)構(gòu)）中的蛋白組分結(jié)合，對(duì)維持Paraspeckle結(jié)構(gòu)完整與數(shù)量十分重要。而Paraspeckle可能是核內(nèi)儲(chǔ)存RNA的一個(gè)重要場(chǎng)所［23－24］。lncRNA與疾病特別是腫瘤發(fā)生、發(fā)展間關(guān)系的研究已有許多報(bào)道。最近的研究顯示，HOTAIR的表達(dá)水平升高與乳腺癌的生長與轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。在上皮癌細(xì)胞中過表達(dá)HOTAIR，導(dǎo)致PCR2 在基因組內(nèi)廣范圍地重新分布、并改變組蛋白的甲基化模式，使細(xì)胞更像胚胎成纖維細(xì)胞，同時(shí)增加細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移能力［25］。

4 未來展望

由于lncRNA 種類繁多、結(jié)構(gòu)多樣、序列缺乏保守性，因而給lncRNA的研究帶來很大困難。相信隨著新的技術(shù)進(jìn)步，例如一些類似ChIP（染色質(zhì)免疫沉淀）技術(shù)的引入，通過不同方式鑒定出更多l(xiāng)ncRNA及其介導(dǎo)的生物學(xué)功能，將為我們認(rèn)識(shí)生命過程中，基因表達(dá)在不同層面的調(diào)控大有幫助，隨著作用機(jī)制的闡明，并將產(chǎn)生巨大的應(yīng)用潛力。lncRNA 一級(jí)序列缺乏保守性，我們不能從lncRNA的序列同源性上預(yù)測(cè)其生物學(xué)活性，也不能從其結(jié)合的靶點(diǎn)上推測(cè)其生物學(xué)活性的相似性，其可能的機(jī)制是由于lncRNA的結(jié)合導(dǎo)致蛋白靶分子構(gòu)象改變而影響了功能。未來的研究分析lncRNA 活性仍離不開蛋白質(zhì)分子，尤其是一些與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄激活子或轉(zhuǎn)錄抑制子等。

在生長發(fā)育的不同階段、不同時(shí)期以及其他條件下，確定更多的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子在lncRNA 介導(dǎo)下的作用，對(duì)于我們認(rèn)識(shí)經(jīng)lncRNA 介導(dǎo)的復(fù)雜的表觀遺傳學(xué)修飾很有幫助。通過調(diào)節(jié)lncRNA的表達(dá)，或人工設(shè)計(jì)的lncRNA 調(diào)控分子可望用于腫瘤或其他疾病的基因治療。相信隨著研究的深入，一個(gè)新的領(lǐng)域正在對(duì)我們敞開，為分子生物學(xué)家提供了新的機(jī)遇與挑戰(zhàn)。

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