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環(huán)維黃楊星D新衍生物對(duì)酒精誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

2013-06-12 06:31:16石貞玉厲永強(qiáng)
關(guān)鍵詞:黃楊培養(yǎng)液酒精

石貞玉,厲永強(qiáng)

(1.河南大學(xué) 神經(jīng)生物學(xué)研究所,河南 開(kāi)封 475004;2.河南大學(xué) 護(hù)理學(xué)院,河南 開(kāi)封 475004)

環(huán)維黃楊星D(Cyclovirobuxine D,CVB-D)系從黃楊科植物小葉黃楊(Buxus microphylla Sieb.et Zucc.Var.Sinica Rehd.et Wils)及其同屬植物中提取的一種生物堿,稱(chēng)黃楊寧,亦稱(chēng)環(huán)常綠黃楊堿D、黃楊堿等,屬孕甾烷衍生物[1]。目前認(rèn)為環(huán)維黃楊星D通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、清除自由基等對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用。已有研究[2]發(fā)現(xiàn),環(huán)維黃楊星D 對(duì)急性缺血、缺氧時(shí)的損害性病變有改善和保護(hù)作用,同時(shí),環(huán)維黃楊星D 有促進(jìn)腦缺血損傷區(qū)神經(jīng)功能的修復(fù)作用,對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用。

PC12細(xì)胞是鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤的細(xì)胞株,分化的PC12細(xì)胞在形態(tài)和功能上具有典型的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的特征[3]。兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)在生物體內(nèi)具有較強(qiáng)的生理學(xué)效應(yīng),在腦和神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要的作用,同時(shí)這類(lèi)物質(zhì)具有抗氧化、抗誘變和抗衰老等作用[4-5]。為此,我們的課題通過(guò)對(duì)環(huán)維黃楊星D 進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,以協(xié)同或增效為目的引入具有神經(jīng)保護(hù)作用的兒茶酚胺類(lèi)基團(tuán),合成環(huán)維黃楊星D 兒茶酚新衍生物(HD-X)。實(shí)驗(yàn)采用酒精誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型初步發(fā)現(xiàn),HD-X 對(duì)酒精誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷有較好的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

大鼠嗜鉻神經(jīng)瘤細(xì)胞PC12(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所),生長(zhǎng)在含100mL/L胎牛血清(四季青公司產(chǎn)品)的DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司產(chǎn)品)中,放置在含體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng);HD-X 由河南大學(xué)藥物研究所提供,純度>99%;二甲基亞砜(DMSO,Solarbi公司生產(chǎn)),貯存濃度為1×10-2mol/L;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(Promega公司);乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(上??婆d生物科技有限公司);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 大鼠嗜鉻神經(jīng)瘤細(xì)胞PC12培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10% 滅活胎牛血清、青霉素(100IU/mL)和鏈霉素(100 mg/L)的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)體系中。培養(yǎng)環(huán)境為37℃,含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)共分4組:①正常對(duì)照組:不加任何處理。②酒精損傷組:2×10-1moL/L 酒精。③酒精損傷+HD-X 1 組:1×10-5moL/L的HD-X預(yù)處理30min,再 加2×10-1moL/L酒精。④酒精損傷+HD-X2組:1×10-4moL/L的 HD-X預(yù)處理30 min,再加2×10-1moL/L酒精。繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.2.2 MTT 試驗(yàn) 細(xì)胞以1×104/L接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,0.2mL/孔,繼續(xù)培養(yǎng)24h后換液,分組與處理方法同“1.2.1”。MTT 實(shí)驗(yàn)按照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行。

1.2.3 Hoechst 33258 染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)變化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按1×104個(gè)/mL 濃度接種于提前用多聚賴(lài)氨酸處理的蓋片上,制作細(xì)胞玻片。分組與處理方法同“1.2.1”,繼續(xù)培養(yǎng)24h后,傾去培養(yǎng)液,加入預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次;調(diào)整Hoechst 33258染液濃度至終濃度5 mg/L,37℃避光染色10min;棄去染液,加入體積分?jǐn)?shù)為4% 多聚甲醛4℃固定5min。在熒光顯微鏡下觀察拍攝。激發(fā)波長(zhǎng)在350nm 左右,發(fā)射波長(zhǎng)在460nm 左右。

1.2.4 LDH 活性測(cè)定 酒精損傷發(fā)生后24h收集培養(yǎng)液,用722型分光光度計(jì)在340nm 波長(zhǎng)下測(cè)定LDH的活性。LDH 釋放抑制率=(LDH酒精組-LDHHD-X)/(LDH酒精組-LDH對(duì)照組)×100%。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)細(xì)胞存活率的影響

在有HD-X 保護(hù)的實(shí)驗(yàn)組中,PC12細(xì)胞對(duì)MTT的攝取能力高于模型組(P<0.05 或P<0.01),細(xì)胞存活率升高,表明HD-X 對(duì)酒精誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型具有保護(hù)作用。見(jiàn)表1。

表1 HD-X對(duì)酒精誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷存活率的影響()

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

酒精作用PC12細(xì)胞組中,Hoechst 33258 染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化,表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集,細(xì)胞核碎裂成碎片等典型細(xì)胞凋亡特征性變化,在有HD-X保護(hù)的實(shí)驗(yàn)組中,可見(jiàn)凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯下降。見(jiàn)圖1。

2.3 對(duì)LDH 釋放的影響

PC12細(xì)胞在酒精損傷后釋放至培養(yǎng)液中的LDH 增多,與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而加入含HD-X的2個(gè)劑量組中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中LDH 含量的降低(P<0.05或P<0.01),漏出減少,表示HD-X 對(duì)酒精誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。見(jiàn)表2。

圖3 HD-X對(duì)酒精誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用形態(tài)學(xué)觀察

表2 HD-X對(duì)酒精誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷后細(xì)胞LDH 釋放的影響()

3 討論

研究[6-8]表明,酒精可能通過(guò)增加自由基的產(chǎn)生,影響神經(jīng)遞質(zhì)受體的功能,誘發(fā)神經(jīng)元凋亡,干擾神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路,激活內(nèi)源性的細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑等分子機(jī)制,促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的損傷,與阿爾茨海默氏病及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病有密切聯(lián)系。PC12細(xì)胞為大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤克隆化的細(xì)胞株,與原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞模型相比,具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征,是國(guó)際上基本公認(rèn)在體外進(jìn)行神經(jīng)生物、神經(jīng)化學(xué)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究理想的模型,用于研究多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如阿爾茨海默病,帕金森病等,廣泛用作研究神經(jīng)細(xì)胞分化、離子通道、受體和遞質(zhì)釋放的實(shí)驗(yàn)材料,也是研究神經(jīng)毒性的最主要的細(xì)胞株之一[9]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,酒精對(duì)PC12細(xì)胞具有明顯的抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。而預(yù)先給予HD-X 后,酒精對(duì)PC12 細(xì)胞的增殖抑制作用減輕,細(xì)胞凋亡率下降。LDH 是細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記酶,反映細(xì)胞死亡常用的生化指標(biāo)。培養(yǎng)液中LDH 漏出率在酒精組中明顯高于對(duì)照組,而預(yù)先給予HD-X 后,細(xì)胞上清液中的LDH 含量明顯減少,提示HD-X 可減輕酒精所致的神經(jīng)元損傷,對(duì)神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用。

綜上所述,HD-X 對(duì)酒精誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用,關(guān)于其保護(hù)作用的分子機(jī)制還需要今后不斷的深入研究和探討。

[1]瞿凌晨,邢精紅,許立,等.環(huán)維黃楊星D 對(duì)大鼠心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用初探[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,14(1):67-68.

[2]譚峰,顧衛(wèi),萬(wàn)賽英,等.環(huán)維黃楊星D 對(duì)高血壓大鼠腦缺血神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白與神經(jīng)粘蛋白表達(dá)的影響[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2007,6(4):349-353.

[3]Westerink R H,Ewing A G.The PC12cell as model for neurosecretion[J].Acta Physiol(Oxf),2008,192(2):273-285.

[4]Garcia C R,Angele-Martinez C,Wilkes J A,et al.Prevention of iron-and copper-mediated DNA damage by catecholamine and amino acid neurotransmitters,L-DOPA,and curcumin:metal binding as a general antioxidant mechanism[J].Dalton Trans,2012,41(21):6458-6467.

[5]Shimizu T,Nakanishi Y,Nakahara M,et al.Structure Effect on Antioxidant Activity of Catecholamines toward Singlet Oxygen and Other Reactive Oxygen Species in vitro[J].J Clin Biochem Nutr,2010,47(3):181-190.

[6]Wu D,Cederbaum A I.Alcohol,oxidative stress,and free radical damage[J].Alcohol Res Health,2003,27(4):277-284.

[7]Rump T J,Abdul M P M,Szlachetka A M,et al.Acetyl-L-carnitine protects neuronal function from alcohol-induced oxidative damage in the brain[J].Free Radic Biol Med,2010,49(10):1494-1504.

[8]胡艷秋,蔣杞英,程相樹(shù),等.乙醇對(duì)發(fā)育期小鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量的影響[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2007,26(3):20-22.

[9]Greene L A,Tischler A S.Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1976,73(7):2424-2428.

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