王朝莉，敬保遷，李 麗，馮 莉(川北醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與分子生物學(xué)研究所，南充 637000;通訊作者，E-mail:bqjing@yahoo.com.cn)

胃癌是嚴(yán)重危害人類健康和生命的惡性腫瘤之一，居所有惡性腫瘤之首。研究表明，基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著非常密切的關(guān)系。因此，篩選胃癌特異表達(dá)基因，分析這些基因表達(dá)與胃癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移間的關(guān)系，發(fā)展對胃癌高危人群進(jìn)行篩查或早期實(shí)驗(yàn)室診斷方法，將這些特異表達(dá)基因作為分子靶位，發(fā)展新的抗腫瘤藥物和抗腫瘤疫苗已是目前緊迫需要。本實(shí)驗(yàn)采用抑制消減雜交技術(shù)(SSH)，構(gòu)建胃低分化腺癌cDNA消減文庫，與公共數(shù)據(jù)庫中已知基因和人類EST比較，獲得序列標(biāo)簽，通過RT-PCR技術(shù)進(jìn)行篩選，期望獲得本地區(qū)胃癌標(biāo)本中特異表達(dá)基因，為胃癌的靶向基因治療奠定實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用胃低分化腺癌組織和癌旁正常黏膜組織來源于川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科住院部的胃癌患者(獲得知情者同意情況下)，經(jīng)臨床及病理診斷證實(shí)。主要試劑:RNAiso plus(TaKaRa);PCR Select cDNA Subtraction;50×PCR Enzyme Mix(Clontech);Advantage PCR Cloning(Clontech);NucleoSpin ExtractⅡ(Clontech);PCR Purification(Qiagen);Prime-ScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胃低分化腺癌和癌旁正常黏膜組織總RNA的分離 取胃低分化腺癌和癌旁正常黏膜組織，用RNeasy Mini Kit(Qiagen)試劑盒，按使用說明提取癌組織和癌旁組織總RNA。波長260-280 nm處，核酸蛋白檢測儀進(jìn)行濃度分析和純度鑒定。

1.2.2 cDNA合成 使用Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit(Clontech)，參照使用說明，取胃癌組織和癌旁組織總RNA各2 μg，以RT-PCR方法擴(kuò)增合成雙鏈 cDNA，產(chǎn)物經(jīng) NucleoSpin ExtractⅡ(Clontech)純化。

1.2.3 四堿基內(nèi)切酶RsaⅠ酶切 以胃癌cDNA為檢測子(Tester)，癌旁組織為驅(qū)動(dòng)子(Driver)。取Tester和 Driver的 cDNA 各 43.5 μl，加入 RsaⅠ(10 U/μl)1.5 μl，置于37 ℃2 h。常規(guī)酚 -氯仿 -異戊醇抽提，無水乙醇沉淀。

1.2.4 連接相應(yīng)接頭 RsaⅠ酶切后的胃癌組織分為2組:Tester1和 Tester2，分別連接相應(yīng)的接頭Adaptor 1和Adaptor 2R。每組各加入Tester cDNA 2 μl及T4DNA 連接酶1 μl，分別與Adaptor 1 和Adaptor 2R于16℃反應(yīng)過夜。

1.2.5 兩次消減雜交反應(yīng) 將連有接頭Adaptor 1和Adaptor 2R的TestercDNA 1.5 μl分別與經(jīng)RsaⅠ酶切后的Driver cDNA 1.5 μl于68℃8 h進(jìn)行第一次消減雜交;然后混合2份雜交標(biāo)本，加入過量新鮮變性的Driver cDNA 1 μl，于68℃雜交過夜進(jìn)行第二次消減雜交。

1.2.6 兩次PCR擴(kuò)增反應(yīng) 以PCR Select cDNA Subtraction試劑盒(Clontech)進(jìn)行。以稀釋后的第二次消減雜交產(chǎn)物為模板，以試劑盒中的引物1進(jìn)行第一輪抑制性PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為:75℃5 min;94℃30 s，以 94 ℃30 s、66 ℃ 30 s、72 ℃ 1.5 min，27個(gè)循環(huán);最后72℃6 min。再將稀釋后的第一輪PCR產(chǎn)物作為模板，以試劑盒中的巢式PCR引物1和引物2進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為:94 ℃30 s、68 ℃30 s、72 ℃1.5 min，20 個(gè)循環(huán)。以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)量，并以PCR Purification(Qiagen)純化PCR產(chǎn)物。

1.2.7 消減雜交后PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定 將上述PCR產(chǎn)物與pGEM-Tasy(Promega)載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 JM109，鋪于含 x-gal，IPTG，Amp的Luria-Bertani培養(yǎng)基平板，藍(lán)白斑篩選和快速瓊脂糖凝膠電泳方式鑒定陽性克隆，隨機(jī)挑選29個(gè)克隆送上?；瞪锛夹g(shù)有限公司進(jìn)行測序，通過Gen-Bank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)檢索和同源性分析。

1.2.8 半定量RT-PCR分析 收集5例新鮮的胃癌及癌旁正常黏膜組織，以RMPI 1640培養(yǎng)液洗滌3次，液氮研磨后加入適量RNAiso plus(TaKaRa)，按試劑說明書進(jìn)行RNA提取，凝膠電泳及核酸蛋白儀鑒定質(zhì)量和含量。使用PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒(TaKaRa)，參照使用說明，取胃癌組織和癌旁組織總RNA各1 μg，合成cDNA。將通過GenBank檢索獲得的序列標(biāo)簽進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物分別為:NBPF1V-F:5’-TCACTCCAGATGAGCCAGACA-3’，NBPF1V-R:5’-CCTCAGGGACTTTGCTTTCTT-3’;RXFP2-F:5’-CTGATTGCCTGATGGGTGTT-3’，RXFP2-R:5’-ATGACTGAGGTCTGCCGTTTT-3’;QDPR-F:5’-CCATCTGGCTACCAAGCATCT-3’，QDPR-R:5’-AGGGTAACCGGGAGCACACAG-3’;FAM48AV1-F:5’-CCGAGAACAGACCTGAGCAA-3’，F(xiàn)AM48AV1-R:5’-TGTATGCCGATGATGATGTAGC-3’;FAM48AV2-R:5’-T TAGTCCAGAATGAAGCCAAATGTC-3’，F(xiàn)AM48AV2-R:5’-ATACCGAAGACTGAACTGACACG-3’;RPL13A-F:5’-AGCTCATGAGGCTACGGAAA-3’，RPL13A-R:5’-CTTGCTCCCAGCTTCCTATG-3’;RPL19-F:5’-ATCGATCGCCACATGTATCA-3’，RPL19-R:5’-GCGTGCTTCCTTGGTCTTAG-3’。

擴(kuò)增體系:25 μl體系。反應(yīng)條件:94℃3 min預(yù)變性，94 ℃30 s，59 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞總RNA的提取

用RNeasy Mini Kit(Qiagen)試劑盒提取胃低分化腺癌和癌旁正常黏膜組織總RNA，電泳結(jié)果顯示條帶清晰，結(jié)構(gòu)完整，質(zhì)量較好［1］，可以繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 消減雜交

以RsaⅠ酶切的胃癌cDNA為tester，正常組織cDNA為driver進(jìn)行SSH和抑制性PCR，產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示，在200-800 bp之間的存在一系列基因片段(見圖1)。

2.3 序列克隆與測序分析

通過GenBank檢索和同源性分析，獲得5個(gè)特異性序列標(biāo)簽，分別是NBPF1基因(neuroblastoma breakpoint family，member 1)，RXFP2 基因，QDPR 基因(醌型二氫蝶呤還原酶基因，quinoid dihydropteridine reductase)，F(xiàn)AM48A基因(亦稱 C13orf19)和ACTB基因。

2.4 RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

采用半定量 RT-PCR方法檢測 NBPF1、FAM48A、RXFP2、QDPR基因在不同癌組織中的表達(dá)情況，同時(shí)以RPL19和RPL13A作為內(nèi)參基因(見圖2)。結(jié)果表明:RXFP2在不同的組織中均表達(dá)，且在癌組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，富有規(guī)律性;QDPR在所取的標(biāo)本中未見表達(dá);NBPF1僅在部分標(biāo)本中表達(dá);而FAM48A的兩種變異體中，F(xiàn)AM48A1表達(dá)不全，F(xiàn)AM48A2特異性不強(qiáng)。

圖1 消減效率分析結(jié)果Fig 1 PCR analysis of subtraction efficiency

圖2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)篩選Fig 2 Screening of differentially expressed genes by reverse transcription-polymerase chain reaction

3 討論

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因多步驟的過程，只有在確定癌發(fā)生發(fā)展中相關(guān)基因的變化后，深入研究這些基因在細(xì)胞分化發(fā)育過程中的具體作用，才能從分子水平闡明胃癌的形成和轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找到針對性較強(qiáng)的控制方法。抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)是近年發(fā)展的能高效快速克隆差異表達(dá)基因的新技術(shù)之一。它以抑制性PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)，將標(biāo)準(zhǔn)化測試cDNA單鏈步驟和消減雜交步驟合為一體，是一種鑒定、分離組織細(xì)胞中選擇性表達(dá)基因的有效方法。本實(shí)驗(yàn)采用SSH技術(shù)從川東北地區(qū)臨床患者胃癌組織中篩選癌組織特異表達(dá)基因的序列標(biāo)簽NBPF1、FAM48A、RXFP2、ACTB和QDPR，通過RT-PCR技術(shù)進(jìn)行篩選，獲得在胃癌組織及癌旁正常黏膜組織中差異表達(dá)基因RXFP2。

RXFP2，是一種糖蛋白激素，富含多個(gè)亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體，富含大量N末端的胞外域的7次跨膜蛋白。其特異配體為胰島素樣激素3(INSL3)［2-4］，又稱松弛素樣因子或睪丸間質(zhì)細(xì)胞源胰島素樣肽。INSL3的氨基酸序列含有A，B 2個(gè)肽鏈，其肽鏈與胰島素樣激素超家族成員的A、B鏈的同源性很高，B鏈的C末端一段序列是INSL3與其受體結(jié)合的關(guān)鍵部位。INSL3表達(dá)于各種生殖組織，被認(rèn)為是人類睪丸間質(zhì)細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志。特別應(yīng)指出的是，近年研究表明，RXFP2參與了人前列腺癌［5］、肝癌［6］和甲狀腺癌［7，8］的侵襲與轉(zhuǎn)移。但是否參與了胃癌的侵襲與轉(zhuǎn)移直至目前也還未見報(bào)道。

本研究采用高通量方法從臨床病理標(biāo)本中篩選出川北地區(qū)胃癌特異表達(dá)RXFP2基因，為臨床胃癌高危人群的篩選、早期診斷、病情考核奠定實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。

［1］ 王朝莉，李麗，陳果，等.川北地區(qū)胃癌特異性表達(dá)基因的克?。跩］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，8(5):19-20.

［2］ Claasz AA，Bond CP，Bathgate RA，et al.Relaxin-like bioactivity of ovine insulin 3(INSL3)analogues［J］.Eur J Biochem，2002，269(24):6287-6293.

［3］ Kubota Y，Net S，F(xiàn)armer PJ，et al.Leydig insulin-like hormone，gubernacular development and testicular descent［J］.J Urol，2001，165(5):1673-1675.

［4］ Tomboc M，Lee PA，Mitwally MF，et al.Insulin-like 3/relaxin-like factor gene mutations are associated with cryptorchidism［J］.J Clin Endocrinol Metab，2000，85(11):4013-4018.

［5］ Klonisch T，Müller-Huesmann H，Riedel M，et al.INSL3 in the benign hyperplastic and neoplastic human prostate gland［J］.Int J Oncol，2005，27(2):307-315.

［6］ Lin CK，Jin JS，Yu CP，et al.Expression of LGR8 and related biomarkers in hepatocellular carcinoma:correlation with clinicopathological parameters［J］.Chin J Physiol，2011，54(3):161-168.

［7］ Hombach-Klonisch S，Hoang-Vu C，Kehlen A，et al.INSL-3 is expressed in human hyperplastic and meoplastic thyrocytes［J］ .Int J Oncol，2003，22(5):993-1001.

［8］ Hombach-Klonisch S，Bialek J，Radestock Y，et al.INSL3 has tumor-promoting activity in thyroid cancer［J］.Int J Cancer，2010，127(3):521-531.

［9］ 李麗，王朝莉，陳果，等.抑制性消減雜交篩選食道癌相關(guān)基因［J］.川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007 ，22(5):421-424.