信 波，殷繼鵬，王艷霞，崔 穎，張立成，王瑞安(解放軍第88醫(yī)院腫瘤科，泰安 7000;第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院病理科;第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院消化病院;第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院臨床實驗與檢驗、輸血科;通訊作者，E-mail:wangra@fmmu.edu.cn)

原發(fā)性肝癌(簡稱肝癌)是當今世界范圍內(nèi)第6常見的惡性腫瘤，但因預后差，生存時間短，死亡率居所有惡性腫瘤的第3位。我國屬于肝癌高發(fā)地區(qū)，新發(fā)病例占全球的55%左右，且我國肝癌患者發(fā)病年齡較輕、病情進展較快。由于發(fā)病早期多無典型的臨床癥狀，初診肝癌患者多為Ⅲ-Ⅳ期，從而導致肝癌手術切除率較低、總體預后較差［1，2］。因而明確肝癌的發(fā)病機制、生物學特性及實現(xiàn)對肝癌的防治是我國醫(yī)學工作者面臨的迫切課題。因此，合適的肝癌動物模型是肝癌基礎與臨床研究工作中的重要材料。

圖1 BALB/c小鼠致肝癌模型在不同時期肝臟組織鏡下表現(xiàn) (HE，×100)Fig 1 Morphological changes of liver tissues in liver neoplasm models of BALB/c mouse at different stage (HE，×100)

圖2 BALB/c小鼠致肝癌模型在不同時期胰腺組織鏡下表現(xiàn) (HE，×100)Fig 2 Morphological changes of pancreas in liver neoplasm models of BALB/c mouse at different stage (HE，×100)

目前雖有報道可用CCl4等化學制劑誘發(fā)小鼠肝癌，但成功率偏低，誘導時間較長(8-20個月)，且誘癌過程中死亡率高［3］。單純應用二乙基亞硝胺(DEN)雖能在20周內(nèi)成功誘發(fā)大鼠肝癌［4］;但發(fā)現(xiàn)單純使用DEN行小鼠誘發(fā)肝癌實驗中，可能同時誘發(fā)出小鼠肝、肺和消化道等多種腫瘤［5］。且目前在轉基因或基因敲除小鼠的相關研究中尚無合適的小鼠肝癌模型可供比較研究［6，7］。故我們嘗試采用改進過的DEN/CCl4/乙醇誘導BALB/c雄性小鼠產(chǎn)生肝腫瘤，并在造模過程中觀察小鼠肝臟、胰腺及肝組織超微結構的改變。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 BALB/c雄性健康小鼠，6-8周齡，體重20-25 g，購自第四軍醫(yī)大學實驗動物研究所。所有動物實驗均符合第四軍醫(yī)大學實驗動物研究所管理委員會動物管理和使用的有關規(guī)定執(zhí)行。

1.1.2 主要試劑 DEN購自天津化學試劑研究所;多聚甲醛、CCl4購自天津市紅巖化學試劑廠;乙醇購自陜西寶雞酒精廠;蘇木精、伊紅購自上海化學試劑廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 誘癌方法 將小鼠按體重從小到大編號，查隨機數(shù)字表獲得隨機數(shù)，將每個動物的隨機數(shù)從小到大排列，1-14號為實驗1組(60 d處死組)，15-28號為實驗2組(90 d處死組)，29-42號為實驗3組(120 d處死組)，43-56號為實驗4組(150 d處死組)，57-78號為對照組(PBS緩沖液組)，即實驗組每組14只小鼠和對照組22只小鼠。實驗組小鼠第1天腹腔注射DEN 100 mg/kg(生理鹽水配制)。第4天開始用CCl4和橄欖油混合液(配制體積比1∶4)灌胃，5 ml/kg，每周2次。第3周再行DEN的生理鹽水溶液灌胃1次，50 mg/kg，同時開始用9%的乙醇溶液喂養(yǎng)，從第4周起將CCl4橄欖油溶液灌胃劑量加大至8 ml/kg，每周2次;同時以正常小鼠顆粒飼料喂養(yǎng)。對照組小鼠僅以正常小鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲用蒸餾水，同時以PBS緩沖液灌胃作對照，8 ml/kg，2 次/周。于第 60，90，120 和 150 天處死相應的實驗組小鼠并取材肝臟及胰腺組織，對照組小鼠于第60，90和120天各取材4只，余10只對照組小鼠于第150天取材。

1.2.2 光鏡下觀察 在上述取材時間點取材實驗組及對照組小鼠肝和胰腺組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm厚的連續(xù)切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡觀察。

1.2.3 透射電鏡觀察 于給藥后第150天時取材實驗4組和對照組小鼠肝組織，切成1 mm3小塊，投入緩沖的2.5%戊二醛固定液中固定2 h，磷酸蔗糖緩沖液沖洗，1%鋨酸后固定1 h，逐步酒精、丙酮脫水，EponS12包埋，制成超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，JEM-2000EX透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4 血糖值測定 于給藥后第150天時，利用便攜式電子血糖儀及試紙條測定小鼠血糖值。測定時，消毒小鼠尾尖，待干燥后剪開尾尖血管，將小鼠尾巴保持下垂，使破損處流出的血液順利吸進試紙條，記錄血糖儀所顯示的測試結果。注意剪開尾尖血管后，勿加力擠壓，以免組織液混入血樣，造成檢測結果偏差。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)處理。計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采t檢驗;計數(shù)資料兩組間比較采取Fisher確切概率法。檢驗水準a=0.05。

2 結果

2.1 小鼠肝腫瘤誘發(fā)情況

實驗組小鼠在誘癌過程中共死亡19只，主要發(fā)生在第1-2個月。在相應時間點取材實驗組小鼠病變肝組織時，實驗1組小鼠存活9只，實驗2組存活9只，實驗3組存活10只，實驗4組存活9只。造模過程中，對照組小鼠未出現(xiàn)死亡，平均體重增加明顯，達(34.9±1.9)g;而實驗組存活小鼠僅增長至(28.2±2.2)g，較對照組小鼠體重減輕明顯(P＜0.05)。

肝臟組織鏡下觀:對照組小鼠在不同的取材時點，肝細胞均排列正常，肝板規(guī)則(圖1，見第245頁)。實驗組存活小鼠肝臟組織于給藥后第60天出現(xiàn)炎癥，第90天發(fā)生肝纖維化，第120天肝纖維化改變加重。第150天時，實驗4組存活小鼠均出現(xiàn)肝細胞排列紊亂，細胞多呈多角形，胞質(zhì)豐富，核大，有清楚的核仁，細胞異型性明顯，符合中、高分化肝細胞癌(HCC)特征(圖1，見第245頁)。

2.2 小鼠胰腺及血糖變化

胰腺組織鏡下觀:正常小鼠胰腺組織結構完整，細胞形態(tài)佳。實驗組存活小鼠第90天時，胰腺出現(xiàn)散在的脂肪變性;第120天時，脂肪變性范圍較前加大，但細胞內(nèi)變性的程度較前減輕;第150天時，脂肪變性病變范圍和程度均加大，甚至出現(xiàn)變性壞死區(qū)(圖2，見第246頁)。

給藥后第150天時，測量正常小鼠和實驗4組小鼠的血糖值，實驗4組小鼠血糖值較對照組小鼠低［(6.33±1.06)mmol/L vs(10.43±2.25)mmol/L，P ＜0.05］。

2.3 小鼠肝臟組織超微結構改變

造模第150天時，透射電鏡下觀察肝組織超微結構:對照組肝細胞細胞核以常染色質(zhì)為主，分布均勻(見圖3A);胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等細胞器的形態(tài)、數(shù)量及分布正常，未見異常(見圖3B);肝細胞膽小管面，微絨毛豐富(見圖3C)。實驗4組存活小鼠肝細胞胞核大而扭曲，核仁大、量多，胞質(zhì)少，核漿比例大(見圖3D);胞質(zhì)內(nèi)線粒體增多造成嗜酸性改變，脂滴沉積和糖原沉積多見，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張明顯(見圖3E);細胞間毛細膽管微絨毛減少，外質(zhì)區(qū)擴張，膽汁淤積(見圖3F);并可見瘤巨細胞(見圖3D)。

圖3 BALB/c小鼠致肝癌模型造模第150天時透射電鏡下表現(xiàn)Fig 3 Changes of ultrastructure in liver neoplasms models of BALB/c mouse at 150 d

3 討論

理想的動物模型，可為研究疾病發(fā)病機制和探尋有效治療途徑提供助力。目前DEN誘發(fā)的鼠肝癌模型被廣泛應用于肝癌病因、發(fā)病機制、化學預防等方面的研究。既往經(jīng)典的DEN誘發(fā)肝癌的方式多為由“飲水法”誘發(fā)的大鼠肝癌模型，雖然造模方法簡單，成癌率高;但其成模時期較長，造模成本較高［8，9］。本研究根據(jù)癌變的二階段學說［10］，在第一階段即特異性的激發(fā)階段，使用小劑量的致癌物DEN使正常小鼠肝細胞轉變?yōu)闈摲约毎?。在第二階段即非特異性的促進階段，選用已知的可促人類肝癌發(fā)生的促癌物CCl4和酒精使?jié)摲约毎M一步發(fā)展成為腫瘤。在誘導過程中實驗組小鼠共死亡19只，主要發(fā)生在第1-2個月。除因灌胃方法不熟練致死的2只小鼠及冬季動物房氣溫過低引起凍傷致死的6只小鼠外，其余小鼠死亡考慮與二甲基亞硝胺及CCl4的毒性作用有關。但該誘導方法與之前的誘導方式相比，成模周期較短，致死率較低，且形態(tài)學結果提示存活的實驗組小鼠成癌率達100%。

在小鼠給藥后第150天時，實驗組小鼠肝臟腫瘤性病變組織超微結構的改變，包括細胞核形態(tài)的改變、核分裂像的增加、巨核細胞的出現(xiàn)，胞質(zhì)內(nèi)的脂肪變性和糖原的大量積聚，線粒體結構的改變和毛細膽管的發(fā)育不佳等，均與人類肝癌超微結構的改變［11］類似，這為探討肝癌發(fā)生過程中肝細胞超微結構的改變及可能導致的細胞功能改變的相關研究打下了基礎。

此外，在造模過程中實驗組小鼠胰腺出現(xiàn)脂肪變性，血糖值也較正常小鼠低?？紤]實驗4組存活小鼠胰腺病變已引起低血糖;造模過程中實驗組小鼠狀態(tài)不佳除了與肝臟病變相關外，還可能與低血糖相關?；瘜W試劑的毒性及肝臟病變可能導致了胰腺病變的發(fā)生。胰腺病變這一發(fā)現(xiàn)在之前的文獻中未見報道;也提示我們在誘發(fā)性肝腫瘤造模過程中，應當對相關重要臟器進行觀察，可能為提高動物在造模過程中生存率及成功率提供助力。但仍需進一步研究肝腫瘤誘發(fā)過程中胰腺的形態(tài)改變以及血糖值的變化，以明確其發(fā)生機制。

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