李松林，李 霏，劉新莉，尹元琴(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所二室，沈陽 000;遼寧省腫瘤醫(yī)院血液生物治療科;通訊作者，E-mail:yuandouwang@yahoo.com.cn)

乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，目前在我國的發(fā)病率逐年增加，且有年輕化趨勢。因此，研究乳腺癌的治療新策略顯得尤為重要。研究表明，肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)是由間質(zhì)細胞產(chǎn)生的一種多功能細胞因子［1］，通過結(jié)合其受體c-Met使其激活成p-Met，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用［2］。NK4是一種新的肝細胞生長因子拮抗劑，它是由HGFα鏈的447個氨基酸和4個kringle結(jié)構(gòu)所組成，故命名為NK4，相對分子量是50 kD［3］。NK4能夠與c-Met受體結(jié)合，但并不激活c-Met受體，因此能夠競爭性抑制HGF對c-Met受體的激活作用。研究證實NK4體外可以抑制HGF誘導的多種腫瘤細胞的生長、運動和侵襲［4-7］。但在乳腺癌中的作用，目前國內(nèi)外少見報道。為此我們構(gòu)建了NK4重組慢病毒載體［8］，并進行轉(zhuǎn)染研究，探討NK4基因?qū)GF誘導MDA-MB-231的細胞生長、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

乳腺癌細胞株MDA-MB-231培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2孵箱中。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染

將NK4病毒載體轉(zhuǎn)染到231細胞中，最適感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為 10，載體轉(zhuǎn)染時培養(yǎng)基中添加聚凝胺調(diào)整濃度至8 μg/ml，以正常培養(yǎng)和空白載體轉(zhuǎn)染的細胞作為對照。

1.3 轉(zhuǎn)染細胞NK4基因mRNA水平表達檢測

取NK4轉(zhuǎn)染組、空載體組和對照組細胞各5×106，常規(guī)提取總RNA，參照NK4基因序列設(shè)計引物，上游引物:5’-ATCAGGCAAGATTTGTCAGCG-3’;下游引物:5’GAGCAGTAGCCAACTCTCGGAT-3’。用上述兩種引進行RT-PCR反應(yīng)，陽性者可擴增出453 bp片段。β-actin作為內(nèi)參照。

1.4 NK4蛋白和p-met蛋白表達的檢測

采用Western blot法檢測NK4蛋白和p-met蛋白表達。NK4轉(zhuǎn)染組、空載體組和對照組的細胞孵育2 d，分別收集對數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)液上清和細胞裂解液。聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，5%牛奶封閉，加入兔抗人單克隆抗體4℃過夜，TBST洗3次，加入二抗，TBST沖洗3次后加入ECL發(fā)光液曝光。

1.5 細胞生長曲線測定

按照每孔5×103個細胞接種于96孔板，分為MDA-MB-231組和NK4轉(zhuǎn)染組，每組設(shè)5個復孔，每組加入10 ng/ml的HGF。每孔加入MTT溶液10 μl，37 ℃ 培養(yǎng)，4 h 后加入 DMSO 150 μl震蕩 10 min。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm讀取吸光值。抑制率計算公式為:抑制率=1-(實驗孔A值-空白孔A值)/(對照孔A值-空白孔A值)。

1.6 細胞侵襲能力測定

采用8 μm的Transwell chamber，對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞組，空載體組和NK4轉(zhuǎn)染組，胰酶消化后，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整成1×105的細胞懸液，上室每孔加入0.5 ml的細胞懸液(即每孔5×104個細胞)，下室加入含有10 ng/ml HGF的培養(yǎng)基孵育48 h。取出濾膜，用棉簽擦盡上室面Matrigel和未侵襲的細胞，10%中性甲醛固定30 min，常規(guī)HE染色，200倍光鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)濾膜下室面的細胞數(shù)，以平均數(shù)作為侵襲指數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行 t檢驗和方差分析及兩樣本比較的LSD檢驗。數(shù)據(jù)以±s表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染細胞NK4 mRNA基因的表達

對NK4轉(zhuǎn)染組、空載體組和對照組樣品進行RT-PCR反應(yīng)，均可擴增出長度為1 434 bp的特異性條帶，而空載體組和對照組則沒有特異性條帶。說明NK4轉(zhuǎn)染乳腺癌后能夠正常轉(zhuǎn)錄(見圖1)。

圖1 三組細胞中NK4基因的表達Fig 1 Identification of NK4 gene

2.2 轉(zhuǎn)染細胞NK4蛋白和p-met蛋白的表達

取NK4轉(zhuǎn)染組、空載體組和對照組細胞培養(yǎng)液上清液進行Western blot實驗，結(jié)果顯示:NK4轉(zhuǎn)染組能夠表達NK4蛋白，而對照組和空載體組中無NK4表達，且與對照組和空載體組相比轉(zhuǎn)染組中pmet蛋白的表達明顯減弱(見圖2)。

圖2 各組細胞中NK4及p-met的表達Fig 2 Expression of NK4 and p-met in three groups

2.3 細胞生長曲線測定

結(jié)果顯示NK4轉(zhuǎn)染組與對照組和空載體組相比能夠明顯抑制由HGF誘導的細胞生長(P＜0.01，見圖3)。

2.4 細胞侵襲能力測定

Transwell小室法觀察轉(zhuǎn)染NK4基因?qū)θ橄侔┘毎忠u的影響，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NK4能夠顯著抑制HGF誘導的乳腺癌細胞的侵襲(P＜0.01，圖4，5，見第248頁)。

圖3 轉(zhuǎn)染NK4對MDA-MB-231細胞的抑制作用Fig 3 The cell inhibition of NK4 on MDA-MB-231

圖4 Transwell小室法觀察轉(zhuǎn)染NK4基因?qū)θ橄侔┘毎忠u的影響 (×100)Fig 4 Effect of NK4 transfection on MDA-MB-231 invasion by Transwell assay (×100)

圖5 對照組、空載體組及轉(zhuǎn)染NK4組48 h后MDA-MB-231侵襲情況對比Fig 5 The inhibition on MDA-MB-231 invasion of null，vector and p-Lenti-NK4 at 48 h

3 討論

乳腺癌已經(jīng)成為女性最常見的惡性腫瘤之一，占女性所罹患的全部惡性腫瘤的23%［9］，在美國乳腺癌已經(jīng)成為女性惡性腫瘤第一位［10］。因此研究乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的機制，探索有效地抑制乳腺癌的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的方法顯得至關(guān)重要。

HGF是由間質(zhì)細胞產(chǎn)生的一種多功能細胞因子。最初引起對肝細胞具有很強的絲裂原作用而命名［1］。HGF具有誘導細胞有絲分裂、刺激細胞遷移、對抗細胞因子誘導凋亡的作用。通過包括癌細胞在內(nèi)的多種細胞膜上的特異性受體c-Met發(fā)揮生物學作用［2］。HGF/c-Met可以激活蛋白激酶結(jié)構(gòu)域中的PTK，導致絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)發(fā)生磷酸化上調(diào)u-PA(內(nèi)皮細胞尿激酶-纖溶酶原激活系統(tǒng))，引起一系列的生物反應(yīng)，誘導基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，促進細胞外基質(zhì)的降解，最終導致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［11］。最近，有研究證實乳腺癌中HGF和c-Met的表達與正常組織相比明顯升高，且HGF的水平與乳腺癌的腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)狀況及組織學分級有明顯關(guān)系［12-14］。因此，如果能夠抑制HGF與其受體c-Met的結(jié)合將對乳腺癌的治療起到重要作用。NK4是HGF最具代表性的全面的拮抗劑，它具有拮抗HGF和抑制血管生成的雙重作用。本實驗通過對乳腺癌細胞MDA-MB-231轉(zhuǎn)染NK4重組慢病毒載體，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染NK4基因的細胞組能夠向培養(yǎng)基中大量分泌NK4蛋白，體外實驗結(jié)果顯示NK4能夠競爭性抑制HGF與乳腺癌細胞上cmet受體的結(jié)合，抑制了c-Met受體的磷酸化。從而阻斷了HGF/c-met信號通路對乳腺癌細胞促腫瘤作用，NK4基因的轉(zhuǎn)染能夠明顯地抑制乳腺癌細胞的生長和侵襲，為進一步的體內(nèi)實驗和乳腺癌的臨床治療提供了研究基礎(chǔ)。

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