王 丹，孫紅坤，唐 青，楊曉丹，喬 文(西安交通大學醫(yī)院內科，西安 7006;西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院消化內科;通訊作者，E-mail:qiaowen0@6.com)

腫瘤的多藥耐藥(MDR)是指腫瘤細胞對多種化學結構和作用機制均不相同的化療藥物產生的耐藥性，可分為先天性耐藥(intrinsic MDR)及獲得性耐藥(acquired MDR)［1］。目前有關耐藥的機制研究比較多的有:轉運泵樣作用、細胞內特定酶系統(tǒng)的激活，例如谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)［2］、還有凋亡機制的紊亂，例如Bcl-2家族成員及CD95等［3］。TSA是一種鏈霉素的代謝產物，具有組蛋白脫乙?；种苿┗钚裕?，5］，可以通過影響細胞中核小體組蛋白的乙酰化水平來調節(jié)某些轉錄因子的水平，進而通過調節(jié)相關基因的轉錄與表達來實現(xiàn)抑制腫瘤細胞生長、逆轉腫瘤細胞耐藥的作用。TSA可抑制多種腫瘤細胞的生長并逆轉其耐藥［6-9］，但是對胃癌耐藥細胞是否具有逆轉作用尚不明確，本研究旨在觀察TSA對胃癌耐藥細胞SGC7901/ADR是否具有逆轉作用，并對其作用機制進行探討。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和藥物

TSA為 Fermentek公司產品，用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解后儲存濃度為50 μmol/L，ADR為浙江海正公司產品，用生理鹽水溶解后儲存濃度為460 μmol/L，試驗時倍比稀釋至所需濃度，PCR引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成。

1.2 細胞株及培養(yǎng)條件

胃癌細胞株SGC7901和胃癌耐藥細胞SGC7901/ADR均由第四軍醫(yī)大學消化內科實驗室提供，在含10%小牛血清、雙抗(青、鏈霉素各100 U/100 ml)的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，在37℃，5%CO2濕度適宜條件下生長傳代，實驗時取對數(shù)生長期的細胞。

1.3 MTT法檢測TSA對胃癌耐藥細胞SGC7901/ADR的影響

選擇對數(shù)生長期的SGC7901和SGC7901/ADR細胞，調整細胞濃度為5×104個/ml，分別種植于96孔板內，每孔100 μl，在細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，SGC7901 細胞中分別加入 0.23，0.45，0.90，1.80，3.60，7.19，14.38，28.75 μmol/L 的 ADR，SGC7901/ADR 細胞中分別加入 0.90，1.80，3.60，7.19，14.38，28.75，57.50，115 μmol/L的ADR，陰性對照組用培養(yǎng)基補足體積，空白對照組為DMEM培養(yǎng)液，各設6個復孔，繼續(xù)孵育72 h，加入新鮮配制的 MTT，每孔20 μl，繼續(xù)孵育4 h后，用加樣槍吸掉上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩器震蕩10 min，用酶標儀測得每孔的光密度值(OD值)，檢測波長為490 nm。根據(jù)三次試驗的平均值計算得出存活率及抑制率，用SPSS1 3.0分別得到ADR對SGC7901和SGC7901/ADR的IC50。同樣的細胞處理方法，分別加入 12.5，25，50，100，200，300，400，500 nmol/L的 TSA 干預 SGC7901/ADR 細胞，得出TSA對SGC7901/ADR的IC5(95%細胞存活的藥物濃度即無毒劑量)和IC15(85%細胞存活的藥物濃度即低毒劑量)。最后加入1.5 nmol/L的TSA 和0.45，0.90，1.80，3.60，7.19，14.38，28.75，57.50 μmol/L的ADR干預SGC7901/ADR細胞，得出IC50，通過以下計算公式得出耐藥倍數(shù)，逆轉倍數(shù)及逆轉比率:

抑制率(%)=(1-實驗組光密度值/對照組光密度值)×100%

耐藥倍數(shù)=耐藥株IC50/敏感株IC50

逆轉倍數(shù)=耐藥株IC50/逆轉株IC50

逆轉比率=(1-ADR對逆轉株IC50/ADR對耐藥株IC50)×100%

1.4 流式細胞儀檢測TSA對SGC7901/ADR細胞內ADR濃度的影響6

將5×10個/ml的細胞懸液吹打均勻后，接種于6孔細胞培養(yǎng)板內，待細胞貼壁后，分別加入1.5 nmol/L、12 nmol/L的TSA，空白組用培養(yǎng)基補足體積，分別作用48 h和72 h后，用0.25%的胰酶消化后制成單細胞懸液，800 r/min離心5 min，棄上清，用冷PBS溶液洗滌細胞，800 r/min離心5 min，棄上清，再重復一次，用 PBS溶液重懸后上機檢測。ADR在細胞內可發(fā)出熒光，其熒光強度與濃度成正比［10］，用流式細胞儀的免疫熒光計數(shù)進行檢測，設定激發(fā)波長為488 nm，接受波長為575 nm。

1.5 RT-PCR法檢測TSA對SGC7901/ADR細胞內MDR1表達的影響

細胞培養(yǎng)及處理同前，分別加入1.5 nmol/L和12 nmol/L的TSA，空白組用培養(yǎng)基補足體積，作用48 h、72 h后，TRIzol法抽提細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，在PCR擴增儀上進行 DNA擴增，取5 μl反應產物加入2%瓊脂糖凝膠中70 V電泳30 min，用灰度分析儀直接分析各條電泳條帶的灰度值，反應中的引物序列見表1。

表1 MDR1及內參引物序列Tab 1 MDR1 and β-actin primer sequences

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 MTT法檢測TSA對胃癌耐藥細胞SGC7901/ADR的影響

胃癌耐藥細胞SGC7901/ADR相對于SGC7901的耐藥倍數(shù)約為29.51倍。TSA作用于耐藥細胞SGC7901/ADR的IC5=(1.52±0.118)nmol/L、IC15=(12.35±0.399)nmol/L。1.5 nmol/L的TSA作用于SGC7901/ADR后可使其耐藥性明顯降低，逆轉倍數(shù)約為1.95倍，逆轉比率約為48.70%，TSA作用前后耐藥細胞的抑制率見表2，可以明顯看到TSA作用后相同濃度下阿霉素對SGC7901/ADR細胞的抑制率明顯升高。

表2 TSA作用前后SGC7901/ADR細胞的抑制率Tab 2 The inhibition rate of SGC-7901/ADR cells after giving TSA

2.2 TSA對SGC7901/ADR細胞內ADR濃度的影響

TSA作用后耐藥細胞內ADR熒光強度明顯增加，且隨著作用時間延長和TSA劑量增加，耐藥細胞內ADR熒光強度逐漸增加(見表3)。

表3 TSA作用后ADR的熒光強度變化Tab 3 The changes of ADR fluorescence intensity after giving TSA

2.3 TSA對SGC7901/ADR細胞內MDR1表達的影響

RT-PCR法檢測各組細胞內MDR1基因的mRNA表達結果見圖1。用灰度分析儀對各組條帶進行灰度分析，結果見表4。可見隨著TSA作用時間延長和作用劑量增加MDR1表達顯著降低。

圖1 TSA作用后MDR1的變化Fig 1 The change of MDR1 expression after giving TSA

表4 TSA作用后各組間MDR1 mRNA表達灰度值Tab 4 The changes of gray value of MDR1 mRNA expression after giving TSA

3 討論

本研究通過MTT證實人胃腺癌耐藥細胞SGC7901/ADR相對于SGC7901的耐藥倍數(shù)約為29.51倍，在加入1.5 nmol/L的TSA后可使阿霉素對耐藥株的作用明顯加強，其逆轉耐藥倍數(shù)約為1.95倍，證實了TSA對胃癌耐藥細胞具有逆轉作用。

進一步通過RT-PCR法證實TSA作用后可使耐藥細胞內MDR1基因表達降低，且隨著TSA作用時間延長和作用劑量的增加MDR1表達明顯下降。MDR1基因編碼的正是P-糖蛋白(P-gp)［11］。P-gp是ABC(ATP-binding cassette)膜轉運家族成員之一［12，13］，是一種位于細胞膜上的轉運蛋白，可通過水解ATP供能，逆濃度梯度將抗腫瘤藥物泵出細胞外來實現(xiàn)耐藥［14-16］。MDR1基因表達降低，其表達產物細胞膜上的P-糖蛋白也隨之明顯下降，對細胞內阿霉素泵出作用明顯減弱，使細胞內阿霉素濃度明顯升高，增強阿霉素對腫瘤耐藥細胞的作用，從而實現(xiàn)其逆轉耐藥作用。本實驗通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)TSA作用后耐藥細胞內的阿霉素熒光強度明顯增加，且隨TSA作用時間延長和作用濃度增加呈正比，證實了TSA逆轉耐藥是通過增加細胞內阿霉素濃度來實現(xiàn)的。

但是TSA是如何下調MDR1基因的尚不明確。細胞中有乙?；负腿ヒ阴；?，可通過改變染色質中核小體組蛋白的乙?；絹碚{節(jié)相關基因的轉錄和表達，進而改變細胞的生長進程，正常情況下乙酰化酶和去乙?；柑幱谄胶鉅顟B(tài)。TSA具有去乙?；敢种苿┗钚裕虼送茰y，TSA通過抑制去乙?；富钚?，改變細胞內染色質中核小體組蛋白的乙?；?，進而降低MDR1的表達，逆轉腫瘤細胞的耐藥。

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