汪 婷，孔祥權，王偉華

（1.皖南醫(yī)學院，安徽 蕪湖241000；2.皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院急診內科，安徽蕪湖241000）

N-乙?；?絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸（Ac-SDKP），是由Frindel等于1977年首次從胎牛骨髓中提取的一種生理性造血細胞生長抑制因子，是一種新的有效的抗器官纖維化的四肽。細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）1／2是促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）系統(tǒng)主要的、經典的通路，近年來不斷研究證實ERKl／2參與心、肝、胰、腎、肺等器官纖維化的發(fā)生發(fā)展［1-3］。然而，Ac-SDKP能否通過Ang II介導的ERKl／2信號轉導途徑的調節(jié)發(fā)揮其抗血管纖維化的作用，文獻報道很少。本實驗通過觀察Ac-SDKP對Ang II誘導的血管成纖維細胞膠原合成及基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）、轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）表達的影響，為探討 AcSDKP的抗血管纖維化的可能機制提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周雄性SD大鼠（皖南醫(yī)學院實驗動物中心提供），DEME培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶消化液，Ang II、Ac-SDKP、PD98059（Bachem AG公司，瑞士），Trizol，M-MLV逆轉錄酶（Toyobo公司，日本），Ⅰ型及Ⅲ型膠原單克隆抗體、MMP-2及MMP-9單克隆抗體、TGF-β1單克隆抗體（Sigma公司，美國），肌動蛋白單克隆抗體，波形蛋白單克隆抗體，VIII因子相關抗原多克隆抗體。

1.2 血管外膜成纖維細胞的差速貼壁分離培養(yǎng)及鑒定

取6～8周齡雄性SD大鼠（體質量160～180 g）頸椎脫臼法處死，分離大鼠胸主動脈外膜，切成大小約1mm大小的組織塊，均勻貼于細胞培養(yǎng)瓶壁上，加入含20%血清的細胞培養(yǎng)液DMEM，置于培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)，約6～8周左右可見細胞圍繞組織塊生長至亞融合狀態(tài)，用0.25%胰酶消化后傳代［4］，在倒置顯微鏡下觀察放大的原代和消化傳代后的血管外膜成纖維細胞，以波形蛋白為第一抗體染色時，培養(yǎng)細胞的胞漿內可見棕褐色陽性顆粒。而以肌動蛋白和Ⅷ因子作為第一抗體染色時，細胞內均無陽性顆粒表達，表明培養(yǎng)所得到的細胞為血管外膜成纖維細胞。將第二代培養(yǎng)的血管成纖維細胞調整同步化。

1.3 實驗分組

將第二代細胞以1×108cells／L密度接種于放置無菌蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，按照實驗分組加入相應試劑，實驗分為4組，即（1）對照組：為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；（2）Ang II刺激組：10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中加入10-6mmo l／L的Ang II；（3）AcSDKP作用組：10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中加入 10-6mmo l／L的 Ang II，同時加入 10-9mmo l／L Ac-SDKP；（4）PD98059組：10%胎牛血清 DMEM培養(yǎng)液中加入 10-6mmo l／L的 Ang II、10-9mmo l／LAc-SDKP及 25μmmol／L PD98059。

1.4 血管外膜成纖維細胞膠原蛋白I、膠原蛋白III的檢測

取培養(yǎng)液上清，用RT-PCR檢測膠原蛋白I（Col I）、膠原蛋白 III（Col III）mRNA的表達。以 GAPDH內參照（202 bp），引物序列：正向引物 5’-CTCCACGACATACTCAGCA-3’；反向引物 5’-TGTTGCCATCAACGACCCCTT-3’。Col I引物序列（408 bp）：正向引物 5’-AAGGCA ATGCTGAATCGTCC-3’；反向引物5’-TAGCACCTTTGATACCAAACTGC-3’；Col III引物序列 （298 bp）：正 向 引 物 5’-AGAGCGGAGAATACTGGGTTG-3’；反向引物 5’-CAGTGG TATGTAATGTTCTGGGAG-3’產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，將電泳完畢的瓊脂糖凝膠至于掃描儀上觀察并照相，用圖像分析軟件分析，以各目的基因與GAPDH的比值表示mRNA水平。

1.5 血管外膜成纖維細胞MMP-2、TGF-β1的檢測

用Western blot法將培養(yǎng)的血管外膜成纖維細胞裂解液裂解，離心，收集上清，按蛋白標準曲線測定上清中的蛋白含量，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（每加樣孔中蛋白上樣量90μg），之后將凝膠進行轉膜及MMP-2、TGF-β1印跡雜交（單克隆抗體稀釋度均為1∶200，顯色劑為 DAB）。對硝酸纖維膜上 MMP-2、TGF-β1條帶進行灰度掃描（OD值），以對照組（10%FBS基礎培養(yǎng)液組）的灰度值為1，實驗組數(shù)據(jù)與對照組相比取值，經自動圖像分析系統(tǒng)進行定量分析。

1.6 統(tǒng)計學分析

所有計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包進行分析，采用方差分析和t檢驗，并做相關分析。

2 結果

2.1 血管外膜成纖維細胞鑒定

在倒置顯微鏡下觀察放大的原代和消化傳代后的血管外膜成纖維細胞，波形蛋白染色為深棕色。

2.2 Col I、Col IIImRNA表達結果

如圖1和表1所示Ang II孵育成纖維細胞24 h后可刺激血管外膜成纖維細胞合成分泌I、Ⅲ型膠原，與對照組相比，Ang II組 Col I、Col IIImRNA表達均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Ac-SDKP組與 Ang II組相比，Col I、Col IIImRNA水平分別抑制 48.3%、50.5%（P＜0.05），PD98059組則與Ang II組表達結果相似，兩者相比差異無統(tǒng)計學意義。

Fig.1 Expression of type I、IIIcollagenmRNA in vascular adventitial fibroblasts（RT-PCR）

2.3 Western blot測定蛋白的表達結果

2.3.1 Ac-SDKP對 MMP-2表達的影響 用 Ang II刺激24 h后，MMP-2蛋白表達水平明顯下調，較對照組分別降低62%（P＜0.05，圖2），Ac-SDKP能顯著的上調由Ang II抑制的MMP-2蛋白表達，與Ang II相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），PD98059組與Ang II組蛋白表達相近，差異無統(tǒng)計意義（P＞0.05）。

Tab.1 Changes of Col Iand Col III relative expression levels in different group（±s，n＝3）

Tab.1 Changes of Col Iand Col III relative expression levels in different group（±s，n＝3）

Ang II：Angiotensin II；Ac-SDKP：N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro；Col：Collagen；PD98059：MAPK inhibitor*P＜0.05 vs control group；＃P＜0.05 vs Ang IIgroup

Group Col I／GAPDH Col III／GAPDH Control 0.28±0.03 0.40±0.11 Ang II 0.87±0.21* 0.93±0.27*Ac-SDKP 0.45±0.07＃ 0.46±0.09＃PD98059 0.69±0.12 0.76±0.18

2.3.2 Ac-SDKP對 TGF-β1蛋白表達的影響 AngII能顯著刺激 TGF-β1蛋白表達水平（P＜0.05，圖 2），與Ang II組相比，Ac-SDKP能抑制由Ang II刺激的TGF-β1蛋白表達，其 OD值下降41%（P＜0.05）。

Fig.2 Expression of MMP-2，TGF-β1 protein in different group

3 討論

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展以及疾病的預后和并發(fā)癥的發(fā)生中，都起著重要的作用。血管緊張素II（Ang II）是RAAS的主要效應分子。Ang II及其受體在大多數(shù)疾病中表達增加，對心血管的損害作用，主要是導致心血管纖維化。

Ac-SDKP是一種多功能生理調控因子。早期報道，Ac-SDKP可以通過阻止原始造血干細胞進入S期，使其靜止在Go期，而抑制造血干細胞的活性，作為癌癥放療、化療時的造血保護劑應用于臨床。后來研究發(fā)現(xiàn)Ac-SDKP在調節(jié)膠原的合成與代謝方面也發(fā)揮著重要作用［2、3、5-7］，對抗器官纖維化有著潛在的臨床應用價值。Ac-SDKP也具有顯著的促血管生成作用，Liu等［8］發(fā)現(xiàn)Ac-SDKP可以誘導血管平滑肌的形成，在血管形成過程中起介導作用。本實驗中我們通過Ang II誘導的血管外膜的研究顯示，Ang II可刺激血管外膜成纖維細胞分泌膠原蛋白，增加促纖維化因子TGF-β1的表達，在體內TGF-β1可參與膠原的合成，可以不同方式增加多種細胞外基質的含量，增加成纖維細胞膠原的表達，說明Ang II可通過加強其他生長因子而起作用；而Ac-SDKP組中Col I、Col IIImRNA水平分別抑制48.3%、50.5%，MMP-2水平顯著下調，說明Ac-SDKP可顯著抑制Ang II刺激的Col I、Col III合成分泌，并通過上調MMP來增加膠原的降解。通過Ang II組與Ac-SDKP作用組相比較，Ac-SDKP組 TGF-β1的表達較Ang II組下調41%，可說明Ac-SDKP可下調Ang II刺激的 TGF-β1的表達，降低 Ang II與 TGF-β1的協(xié)同作用［10］。

ERKl／2信號級聯(lián)通路是一條可被廣泛激活的MAPK通路，它能將細胞外信號傳遞到細胞核內，引起胞內特異性蛋白的表達譜變化，從而影響細胞的功能和作用，是許多胞外刺激的共同途徑。ET、Ang II、TGF-β1、血小板源性生長因子（PDGF）等均能激活ERKl／2信號轉導通路。Rhaleb等［9］對 ERKl／2通路在Ac-SDKP抑制內皮素-1（ET-1）誘導的心臟成纖維細胞DNA和膠原蛋白表達中的作用進行了研究，推測Ac-SDKP對ET-1誘導的心臟成纖維細胞增殖及膠原表達的抑制作用部分依賴于ERKl／2通路的阻斷。本實驗中我們通過ERKl／2通道阻斷劑來觀察Ac-SDKP對ERK1／2信號轉導途徑的調節(jié)在血管纖維化形成過程中的作用，結果顯示，PD98059組中Col I、Col IIImRNA表達，MMP-2及 TGF-β1蛋白表達均與 Ang II組相似，差異無統(tǒng)計學意義，表明PD98059阻斷Ac-SDKP作用的信號轉導通路，提示，Ac-SDKP可能抑制Ang II刺激的ERKl／2信號轉導通路而發(fā)揮作用。

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