歐國昆，王睿嫻，李佳佳，曹 紅，連慶泉，李 軍

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院麻醉科，浙江溫州325027）

神經(jīng)病理性疼痛是一種難治性慢性疼痛，常表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、異常性疼痛及痛覺過敏，疼痛本身是一種應(yīng)激因素，可以誘導(dǎo)疼痛的易感性增強(qiáng)和加重疼痛的發(fā)生發(fā)展［1］。應(yīng)激反應(yīng)激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，造成糖皮質(zhì)激素分泌增加，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）表達(dá)上調(diào)，糖皮質(zhì)激素與分布于脊髓的GR結(jié)合后對神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)節(jié)起到關(guān)鍵的作用［2］。前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）作為重要的炎癥和促傷害介質(zhì)，在外周和中樞敏化方面均起著十分重要的作用。環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）則是以花生四烯酸（arachidonicacid，AA）為底物生成前列腺素途徑的關(guān)鍵酶。CCI（chronic constrictive injury，CCI）模型［3］是一種應(yīng)用廣泛、可操作性強(qiáng)的神經(jīng)病理性疼痛動(dòng)物模型。M8046是一種新型的GR拮抗劑，其對疼痛的影響及對脊髓COX-2、PGE2的影響尚未見報(bào)道。本研究擬采用CCI模型探討M8046對神經(jīng)病理性疼痛大鼠行為學(xué)及COX-2、PGE2表達(dá)的影響，旨在闡明M8046減緩神經(jīng)病理性疼痛的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

M8046（M8046-100MG）購自美國 Sigma公司，兔抗COX-2抗體（250609）購自美國 Abbiotec公司，兔單克隆抗體（PV-6001）購自北京中杉金橋公司，大鼠PGE2ELISA試劑盒（201105232）購自上海西唐生物科技有限公司，336爪／尾刺激痛覺測試計(jì)及2390 ELECTRO von-Frey測痛計(jì)購自美國ⅡTC公司，顯微鏡（CX41-12L02）購自日本 Olympus公司，顯微熒光照相系統(tǒng)（Nikon E-800）購自日本Nikon公司。

1.2 動(dòng)物選擇與分組

選用清潔級雄性SD大鼠144只，體重220～250 g，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠分為 4組（n＝36）：假手術(shù)組（Sham組）、模型對照組（CCI組）、M8046處理組（M8046組）及溶劑對照組（SC組）。

1.3 大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型的制備

參照 Bernett法［3］制備 CCI大鼠模型：腹腔注射5%水合氯醛400 mg／kg麻醉下，于大鼠右后肢切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，用4-0號鉻制羊腸線在坐骨神經(jīng)分叉前間隔1mm打4次松結(jié)，松緊度以大腿肌肉或足趾輕微抽動(dòng)為度，CCI大鼠術(shù)后3 d機(jī)械縮足反射閾值（PMWT）和熱縮足反射潛伏期（PTWL）下降30%以上，且出現(xiàn)術(shù)側(cè)爪內(nèi)收，后足輕度外翻和跛行，顯示模型成功可進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，否則予以剔除。而Sham組僅暴露坐骨神經(jīng)不作結(jié)扎，其余操作相同。

1.4 大鼠機(jī)械縮足反射閾值（PMWT）和熱縮足反射潛伏期（PTWL）的測定

于術(shù)前 1 d及術(shù)后 1、3、7、10、14 d測定各組大鼠PMWT和PTWL。將大鼠置于機(jī)械測痛計(jì)的鐵絲網(wǎng)架上，待30 min大鼠安靜后，使用2390 ELECTRO von Frey測痛計(jì)刺激大鼠右后足掌心，加壓至逃避性抬腿或右后肢抽動(dòng)，記錄抬腿時(shí)施加于大鼠足底的最大力度（g），重復(fù)5次，間隔5 min，取平均值即為PMWT。336爪／尾刺激測痛儀測定各組大鼠PTWL值。儀器發(fā)射輻射光照射大鼠右后足底，安靜大鼠逃避性抬腿時(shí)，立刻切斷熱源記錄開始照射至出現(xiàn)縮足逃避反射時(shí)間（s），重復(fù)3次，間隔10～15 min，取平均值即為PTWL，照射截止時(shí)間為25 s，以防大鼠足底灼傷。

1.5 免疫組織化學(xué)法測定脊髓和背根神經(jīng)節(jié)COX-2的表達(dá)

大鼠分別于術(shù)后3、7、14 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)在麻醉下經(jīng)主動(dòng)脈灌注生理鹽水100ml，繼而灌注4%多聚甲醛400 ml處死，制作SD大鼠 L4～5脊髓背角和背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）石蠟切片，60℃烤片后二甲苯梯度酒精脫蠟，PBS沖洗后抗原高壓熱修復(fù)，離開熱源自來水流水冷卻。3%過氧化氫封閉 30min，滴加 1∶200的一抗，4℃孵育 24 h，室溫復(fù)溫30min，滴加二抗37℃水浴孵育30 min后PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染5min，鹽酸化酒精酸化2 s，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，晾干后光鏡觀察。每只動(dòng)物分別取20張脊髓背角和20張背根節(jié)切片，順序3張選1張?jiān)诟弑剁R下對脊髓背角及背根神經(jīng)節(jié)截圖，采用 Image-Pro 5.1圖像分析軟件對COX-2陽性細(xì)胞進(jìn)行染色光密度分析。

1.6 ELISA法測定大鼠脊髓組織PGE2的表達(dá)

大鼠分別于術(shù)后3、7、14 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)取脊髓組織，按每100 mg脊髓組織加4 ml生理鹽水的比例，將脊髓組織用微量研磨器磨碎制成勻漿液，將勻漿液進(jìn)行30倍稀釋后用ELISA試劑盒檢測，按試劑盒說明進(jìn)行操作，終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀在450 nm處測樣本的光密度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后換算出脊髓組織中PGE2的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較采用單因素方差分析（one-factor ANOVA），繼以最小顯著差異法（LSD）行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 腹腔注射 M 8046對 CCI大鼠 PTWL和PMWT的影響

各組間行為學(xué)的基礎(chǔ)值差異不顯著（P＞0.05）。Sham組大鼠術(shù)后未出現(xiàn)術(shù)側(cè)爪內(nèi)收和運(yùn)動(dòng)障礙，且各時(shí)間點(diǎn)PTWL和PMWT變化差異無顯著性。CCI組PTWL和PMWT從術(shù)后第1天開始下降，在第3天降至最低值，與基礎(chǔ)值相比較，差異顯著（P＜0.05），與 Sham組相比，CCI組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)PTWL和 PMWT明顯降低（P＜0.05）；M8046組大鼠術(shù)后PTWL和PMWT亦開始下降，在術(shù)后第3天降至最低。與CCI組相比，PTWL、PMWT均從術(shù)后第3天開始有明顯升高（P＜0.05），表明腹腔持續(xù)注射M8046能緩解CCI大鼠熱痛覺及機(jī)械痛覺過敏；SC組與CCI組各時(shí)間點(diǎn)PTWL與PMWL變化差異不顯著（P＞0.05，表 1、2）。

Tab.1 Changes of paw thermalwithdrawal（PTWL）in four groups of rats（s，±s，n＝12）

Tab.1 Changes of paw thermalwithdrawal（PTWL）in four groups of rats（s，±s，n＝12）

CCI：Chronic constrictive group；M8046：Glucocorticoid receptor antagonist；SC：Solvent controlled group*P＜0.05 vs Sham；＃P＜0.05 vs CCI

Group Pre-2 d 1 d 3 d 7 d 10 d 14 d Sham 12.2±3.9 10.8±3.5 11.4±2.8 12.4±2.0 11.1±2.6 11.8±2.4 CCI 12.7±3.3 9.0±3.5* 6.3±2.0* 6.0±2.5* 5.9±1.0* 7.3±2.3*M8046 12.7±1.7 9.7±2.9 8.9±1.6*＃ 9.5±2.2＃ 10.1±1.5＃ 10.2±1.7＃SC 12.7±4.5 8.9±3.9 7.2±3.3 6.3±1.9 6.5±2.9 6.7±3.2

Tab.2 Changes of pawmechanicalwithdrawal threshold（PMWT）in four groups of rats（s，±s，n＝12）

Tab.2 Changes of pawmechanicalwithdrawal threshold（PMWT）in four groups of rats（s，±s，n＝12）

CCI：Chronic constrictive group；M8046：Glucocorticoid receptor antagonist；SC：Solvent controlled group*P＜0.05 vs Sham；＃P＜0.05 vs CCI

Group Pre-2 d 1 d 3 d 7 d 10 d 14 d Sham 42.3±10.2 34.6±8.4 31.6±7.2 32.0±7.7 32.5±10.4 35.3±9.5 CCI 43.0±7.6 26.3±8.2* 19.6±5.8* 16.2±3.2* 16.1±3.6* 15.8±3.6*M8046 44.4±5.2 28.1±7.2* 26.4±5.6*＃ 29.4±8.0＃ 34.1±8.7＃ 34.4±7.5＃SC 43.4±9.4 24.9±9.8 16.9±3.7 17.5±4.3 14.7±3.4 16.3±4.8

2.2 腹腔注射M 8046對CCI大鼠的脊髓背角和背根節(jié)COX-2表達(dá)的影響

Sham組大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角有少量COX-2陽性細(xì)胞表達(dá)，與 Sham組相比，CCI組術(shù)側(cè)COX-2陽性細(xì)胞表達(dá)顯著增多（P＜0.05），術(shù)后第3天表達(dá)達(dá)到高峰，隨后下降，而第14天達(dá)到另一個(gè)高峰；M8046組術(shù)側(cè)COX-2陽性細(xì)胞表達(dá)趨勢與CCI組的變化一致，但與 CCI組相比，表達(dá)明顯減少（P＜0.05）；SC組術(shù)側(cè) COX-2陽性細(xì)胞表達(dá)與 CCI組基本一致，兩組差異不顯著（P＞0.05，表 3）。腹腔注射M8046對CCI引起背根神經(jīng)節(jié)與脊髓背角的COX-2表達(dá)影響結(jié)果一致。

Tab.3 Changes of the number of COX-2 positive cells in spinal dorsalhorn and dorsal rootganglion in four groups of rats（s，±s，n＝6）

Tab.3 Changes of the number of COX-2 positive cells in spinal dorsalhorn and dorsal rootganglion in four groups of rats（s，±s，n＝6）

COX-2：Cyclooxygenase-2；CCI：Chronic constrictive group；M8046：Glucocorticoid receptor antagonist；SC：Solvent controlled group*P＜0.05 vs Sham；＃P＜0.05 vs CCI

Group Spinal dorsal horn 3 d 7 d 14 d Dorsal rootganglion 3 d 7 d 14 d Sham 21.3±5.1 10.5±3.4 15.0±3.5 11.9±3.0 8.0±2.2 5.1±2.4 CCI 50.0±13.8* 31.3±6.1* 53.0±9.9* 16.2±3.0* 24.4±7.6* 24.5±4.9*M8046 25.0±5.8＃ 12.7±3.1＃ 25.3±5.5＃ 12.0±2.2＃ 13.0±2.6*＃ 9.5±2.5＃SC 47.2±10.2 33.9±8.6 46.3±10.0 16.5±2.9 24.5±3.7 25.5±2.8

2.3 腹腔注射 M 8046對 CCI大鼠的脊髓組織PGE2的影響

Sham組大鼠脊髓組織有少量 PGE2表達(dá)，與Sham組相比，CCI組從第7天開始表達(dá)顯著增多（P＜0.05），術(shù)后第 14天表達(dá)達(dá)到高峰；與 CCI組相比，M8046組的 PGE2表達(dá)明顯減少（P＜0.05）；SC組術(shù)側(cè)PGE2表達(dá)與CCI組基本一致，兩組差異不顯著（P＞0.05，表 4）

3 討論

本研究選擇Bennett法制備CCI模型，作為一種經(jīng)典的神經(jīng)病理性疼痛模型，大鼠可產(chǎn)生明顯的熱痛覺過敏和機(jī)械異常性疼痛，其機(jī)制為外周神經(jīng)損傷和炎癥反應(yīng)誘發(fā)的神經(jīng)病理性改變，模擬了臨床上較為常見的外周神經(jīng)壓迫所引起的神經(jīng)病理性疼痛。

Tab.4 Changes of PGE2 in spinal tissues in four groups of rats（pg，±s，n＝6）

Tab.4 Changes of PGE2 in spinal tissues in four groups of rats（pg，±s，n＝6）

PGE2：Prostaglandin E2；CCI：Chronic constrictive group；M8046：Glucocorticoid receptor antagonist；SC：Solvent controlled group*P＜0.05 vs Sham；＃P＜0.05 vs CCI

Group 3 d 7 d 14 d Sham 313±93 268±61 340±62 CCI 374±79 447±61* 518±99*M8046 382±43 337±106＃ 352±136＃SC 320±119 439±128 622±72

本實(shí)驗(yàn)CCI術(shù)后大鼠出現(xiàn)術(shù)側(cè)跛行，自發(fā)性抬腿和舔足等行為，且對熱和機(jī)械刺激產(chǎn)生明顯的疼痛反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)中觀察到CCI組術(shù)后第1天PTWL和PMWT已明顯下降，術(shù)后第3天大鼠PTWL和PMWT都較術(shù)前下降，為基礎(chǔ)值的49.6%和45.6%，此后繼續(xù)保持痛敏狀態(tài)，與文獻(xiàn)報(bào)道［4］相似，表明模型制備成功。

前列腺素是廣泛存在于動(dòng)物和人體內(nèi)的一組重要的組織激素，在疼痛的產(chǎn)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，其中最主要的是PGE2。鞘內(nèi)注射PGE2誘發(fā)痛覺過敏及觸誘發(fā)痛，癥狀與患者神經(jīng)病理性疼痛臨床表現(xiàn)非常相似［5］，而 PGES-1-／-基因敲除小鼠神經(jīng)病理性疼痛癥狀消失［6］，表明PGE2參與誘發(fā)和／或維持階段神經(jīng)病理性疼痛的形成。PGE2在DRG中能夠通過激活河豚毒素抵抗的鈉通道及電壓依賴性鈣通道直接興奮DRG神經(jīng)元，通過抑制鉀通道、促進(jìn)谷氨酸、P物質(zhì)等的釋放，PGE2還可以增強(qiáng)背根神經(jīng)節(jié)對緩激肽和辣椒素的敏感性誘發(fā)谷氨酸、P物質(zhì)等釋放增多［7］。上述表明PGE2在脊髓痛信息的處理過程中以及脊髓敏化的發(fā)展和維持中起重要的作用。PGE2的合成依賴于限速酶COX-2，后者呈誘導(dǎo)性表達(dá)，生理狀態(tài)下大多數(shù)組織不表達(dá)，在細(xì)胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和細(xì)胞核邊緣起作用，對許多炎癥過程起反應(yīng)。Freshwater等［8］在糖尿病所致神經(jīng)病理性疼痛模型中發(fā)現(xiàn)脊髓COX-2表達(dá)明顯增加，痛覺過敏與COX-2、PGE2的表達(dá)、釋放增加有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過建立CCI神經(jīng)病理性疼痛模型，運(yùn)用免疫組織化學(xué)及ELISA技術(shù)，發(fā)現(xiàn)CCI組術(shù)后第3、7、14天脊髓背角及背根神經(jīng)節(jié)中COX-2的表達(dá)明顯升高，而PGE2于術(shù)后第7天表達(dá)明顯增加，說明大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎所致疼痛引起PGE2的表達(dá)相對于COX-2的表達(dá)有一定的滯后性。

有研究發(fā)現(xiàn)，GR在周圍神經(jīng)損傷后表達(dá)上調(diào)，用GR的拮抗劑RU486可以減輕神經(jīng)病理性疼痛中出現(xiàn)的異常性疼痛和痛覺增敏，梯度給予糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486可劑量依賴地減緩CCI所致神經(jīng)病理性疼痛［2］。

本實(shí)驗(yàn)使用新型糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑M8046腹腔注射具有與RU486相似的減緩大鼠CCI神經(jīng)病理性疼痛的作用。目前一般認(rèn)為GR與神經(jīng)病理性疼痛的形成有關(guān)。在脊髓，GR存在于背角神經(jīng)元，這個(gè)區(qū)域負(fù)責(zé)疼痛的傳遞。GR在神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制尚不完全清楚，但一些現(xiàn)象值得注意：（1）大鼠外周神經(jīng)損傷可增加糖皮質(zhì)激素濃度，腎上腺切除可消除神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛樣的行為；（2）皮質(zhì)酮可延長海馬神經(jīng)元的N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體中介的Ca2＋升高；（3）在脊髓索NMDA受體中介神經(jīng)病理性疼痛，鞘內(nèi)注射NMDA受體激動(dòng)劑劑量依賴性地上調(diào)COX-2的表達(dá)，而NMDA受體拮抗劑MK801處理后COX-2的表達(dá)顯著減少［9］，進(jìn)一步表明NMDA受體能夠直接調(diào)節(jié)COX-2在脊髓中的表達(dá)。然而，上調(diào)的NMDA受體則因鞘內(nèi)注射GR拮抗劑而下降［10］，提示NMDA受體作為GR的下游因子并受其調(diào)節(jié)。

本研究證實(shí)糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑M8046處理后COX-2及其催化產(chǎn)物PGE2的表達(dá)均明顯降低，推測COX-2參與神經(jīng)病理性疼痛的應(yīng)激過程。

綜上所述，腹腔注射M8046可減輕CCI大鼠熱痛覺過敏和機(jī)械痛覺過敏，其機(jī)制可能與抑制疼痛引起的應(yīng)激反應(yīng)，通過拮抗 GR受體后，GR下調(diào)NMDA受體表達(dá)，進(jìn)而減少致痛物質(zhì)COX-2／PGE2的產(chǎn)生有關(guān)。

［1］ Nicholson K，MartelliM F.The problem of pain［J］.JHead Trauma Rehabil，2004，19（1）：2-9.

［2］ Wang S，Lim G，Zeng Q，etal.Expression of centralglucocorticoid receptors after peripheral nerve injury contributes to neuropathic pain behaviors in rats［J］.JNeurosci，2004，24（39）：8595-8605.

［3］ Bennett G J，Xie Y K.A peripheralmononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man［J］.Pain，1988，33（1）：87-107.

［4］ Kurpius D，Wilson N，F(xiàn)uller L，et al.Early activation，motility，and homing of neonatalmicroglia to injured neurons does not require protein synthesis［J］.Glia，2006，54（1）：58-70.

［5］ ParrisW C，Janicki PK，Johnson B，et al.Intrathecal ketorolac tromethamine produces analgesia after chronic constriction injury of sciatic nerve in rat［J］.Can J Anaesth，1996，43（8）：867-870.

［6］ Mabuchi T，Kojima H，Abe T，et al.Membrane-associated prostaglandin E synthase-1 is required for neuropathic pain［J］.Neuroreport，2004，15（9）：1395-1398.

［7］ Vanegas H，Schaible H G.Prostaglandins and cycloxygenases in the spinal cord［J］.Prog Neurobiol，2001，64（4）：327-363.

［8］ Freshwater JD，Svensson C I，Malmberg A B，et al.Elevated spinal cyclooxygenase and prostaglandin release during hyperalgesia in diabetic rats［J］.Diabetes，2002，51（7）：2249-2255.

［9］ Li SQ，Xing Y L，Chen W N，et al.Activation of NMDA receptor is associated with up-regulation of COX-2 expression in the spinal dorsal horn during nociceptive inputs in rats［J］.Neurochem Res，2009，34（8）：1451-1463.

［10］ Wang S，Lim G，Zeng Q，et al.Central glucocorticoid receptorsmodulate the expression and function of spinal NMDA receptors after peripheral nerve injury［J］.JNeurosci，2005，25（2）：488-495.