張琳，林親錄*，陽明輝

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410004）

（2.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長沙410004）

（3.中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長沙410083）

0 引言

β-淀粉樣多肽（Amyloid-β,Aβ）是阿爾茨海默（Alzheimer’s disease,AD）病人腦中老年斑的主要成分[1～2]。Aβ由39～43個氨基酸殘基組成[3]。由于Aβ是兩親性多肽，所以在一定的條件下Aβ可發(fā)生自聚集。其過程為：Aβ由無規(guī)則的α螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為具有β折疊結(jié)構(gòu)的寡聚體（oligomer）；接著，這些寡聚體和單體又相互聚集，快速形成纖維前體（protofibril）；然后，Aβ單體和寡聚體在已經(jīng)生成的纖維前體表面和兩端繼續(xù)聚集，形成光滑、成熟的纖維（fibril）[4]。這些不同階段的聚集物都具有一定的神經(jīng)細(xì)胞毒性，會引起一系列的發(fā)病級聯(lián)，從而造成神經(jīng)元的損傷、甚至死亡，導(dǎo)致AD病發(fā)[5]。因此抑制Aβ自聚集，從而抑制Aβ毒性聚集物的出現(xiàn)，是治療AD病的重要途徑[6～7]。

能夠抑制Aβ自聚集的化合物被稱為Aβ自聚集抑制劑[8～11]。目前Aβ自聚集的抑制劑分為兩類：一類是基于Aβ自聚集的多肽片段（KLVFF）的多肽型抑制劑[12]；另一類是從計(jì)算機(jī)分子數(shù)據(jù)庫中篩選出來的，或者是由動植物中提取出來的小分子化合物[13～15]。在數(shù)以千萬計(jì)的多肽和小分子化合物中，能夠快速、簡便的篩選出對Aβ自聚集有抑制效果的抑制劑，對于AD病的治療有著重要的指導(dǎo)意義。

1 Aβ自聚集抑制劑的篩選存在的挑戰(zhàn)

由于Aβ自聚集的速度快，因此利用常規(guī)的檢測手段無法確定抑制劑的作用對象（單體、寡聚體、纖維前體或纖維）[16]；另外，要確定化合物是否對Aβ自聚集有抑制效果，需要進(jìn)行長時間的觀測（一般為24～48 h），并且需要昂貴的檢測儀器[17～18]。因此面對數(shù)以千萬計(jì)的化合物，對篩選Aβ自聚集抑制劑的方法的要求是，快速、簡便、靈敏、廉價。

2 篩選Aβ自聚集抑制劑的常規(guī)方法

目前，篩選Aβ自聚集抑制劑的方法主要分為兩大類：一類是檢測化合物是否能與Aβ結(jié)合。常用篩選方法有：利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)（例如分子動力學(xué)模擬技術(shù)，molecular dynamics simulations,MD）計(jì)算化合物與Aβ的結(jié)合位點(diǎn)[19～20]；利用表面等離子體激光共振（surface plasmon resonance,SPR）技術(shù)檢測化合物與Aβ的結(jié)合常數(shù)[21]等[22]。但此類方法一般要結(jié)合其他檢測手段，才能確定能夠與Aβ結(jié)合的化合物是否能抑制Aβ自聚集。另外一類，是動態(tài)的實(shí)時檢測化合物與Aβ混合溶液的理化性質(zhì)，與相應(yīng)的Aβ溶液相比較，從而確定該化合物是否對Aβ自聚集有抑制效果。常用的篩選方法有利用熒光指示劑（比如硫黃素t,ThT）檢測纖維形成的熒光法[23]、利用成像技術(shù)（電鏡、原子力顯微鏡等）檢測Aβ聚集物形貌的成像法[24～25]和電化學(xué)檢測法[26]等。

2.1 計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)篩選Aβ自聚集抑制劑

通過計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)可得到化合物與Aβ結(jié)合位點(diǎn)以及結(jié)合的能量信息[13,27]。通過這些信息，可預(yù)測該化合物是否可與Aβ結(jié)合，但尚需要通過其他實(shí)驗(yàn)手段（比如熒光指示劑ThT檢測纖維的生成、AFM檢測不溶性聚集物的生成等）來驗(yàn)證化合物是否能夠抑制Aβ的自聚集過程[28]。因此，計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)只能對化合物起到初步篩選的作用[28]。目前此種方法大部分用于Aβ自聚集抑制劑的初步篩選和Aβ抑制劑抑制Aβ自聚集的機(jī)理研究方面。

2.2 SPR技術(shù)篩選Aβ自聚集抑制劑

SPR技術(shù)可以得到化合物與Aβ的結(jié)合常數(shù)，根據(jù)結(jié)合常數(shù)，可以判斷該化合物與Aβ的結(jié)合強(qiáng)度[29]。但化合物可以與Aβ結(jié)合并不意味著可抑制Aβ自聚集。所以，與計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)類似，還需要利用其它檢測手段來確定該化合物是否是Aβ自聚集的抑制劑。例如，用空間排阻色譜（size exclusion chromatography,SEC）來檢測化合物與Aβ結(jié)合后，水溶性聚集物（水溶性寡聚體）的產(chǎn)生是否受到抑制；利用原子力顯微鏡或者掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope,SEM），檢測不溶性聚集物（不溶性寡聚體、纖維前體和纖維）的產(chǎn)生是否受到抑制[21]。但SPR的檢測芯片為金膜，在金膜上組裝Aβ或者Aβ自聚集的多肽片段，步驟繁瑣。此外，多肽在金膜表面有非特異性吸附，為了避免非特異吸附引起的SPR信號的變化對結(jié)果造成干擾，芯片需要進(jìn)行封閉。因此利用該方法不僅篩選速度慢，并且過程繁瑣、需要的試劑和儀器都比較昂貴。為了提高篩選效率，基于SPR技術(shù)的高通量的微陣列技術(shù)（microarray）被引入到Aβ自聚集抑制劑的研究中來[30]。但與單通道或者雙通道的SPR技術(shù)類似，微陣列技術(shù)只能檢測到化合物是否能與Aβ結(jié)合，并不能確定該化合物是否能抑制Aβ自聚集的過程。

2.3 ThT熒光技術(shù)篩選Aβ自聚集抑制劑

ThT可以插入到Aβ纖維的β折疊中，從而特異性的與Aβ纖維前體和纖維結(jié)合。同時，插入β折疊中的ThT的熒光信號會大大增強(qiáng)[31]。基于這一原理，ThT被用來動態(tài)監(jiān)測Aβ溶液中纖維的形成，并用于Aβ自聚集抑制劑的篩選[32]。該方法的缺陷是只能檢測到Aβ自聚集后期，纖維前體或者纖維的生成，而在Aβ聚集前期，Aβ單體和可溶性的Aβ寡聚體無法用ThT檢測到。研究發(fā)現(xiàn)，可溶性的Aβ寡聚體具有比纖維更高的神經(jīng)細(xì)胞毒性[33]。因此利用ThT熒光法來篩選Aβ自聚集抑制劑，只能篩選到可抑制Aβ纖維生成的抑制劑，并不能得到可抑制Aβ可溶性寡聚體生成的抑制劑。

2.4 成像技術(shù)篩選Aβ自聚集抑制劑

成像技術(shù)（電鏡、原子力顯微鏡等）可以實(shí)時檢測溶液中不溶性、納米級的聚集物的形態(tài)[34]。通過對聚集物形態(tài)的檢測，可確定抑制劑是否可以抑制Aβ自聚集。與ThT熒光技術(shù)類似，該技術(shù)無法檢測到Aβ自聚集前期，可溶性的Aβ寡聚體或者Aβ單體。Aβ單體不具神經(jīng)細(xì)胞毒性，可溶性寡聚體具有較強(qiáng)的神經(jīng)細(xì)胞毒性[33]。因此無法分辨Aβ單體和寡聚體，就無法分辨該抑制劑是否有抑制Aβ神經(jīng)細(xì)胞毒性的作用。

2.5 電化學(xué)技術(shù)篩選Aβ自聚集抑制劑

電化學(xué)方法簡單、靈敏，可實(shí)時檢測化合物對Aβ自聚集的抑制過程，故電化學(xué)方法在篩選Aβ自聚集抑制劑方面具有廣泛的應(yīng)用[35～36]。電化學(xué)方法篩選Aβ自聚集抑制劑，是從利用電化學(xué)方法檢測Aβ自聚集的過程中發(fā)展起來的[37]。Vestergaard等[38]在2005年首先利用玻碳電極，通過檢測Aβ十位上酪氨酸（tyrosine,Tyr）的電化學(xué)信號，實(shí)時檢測了Aβ(1-42)和Aβ(1-40)的自聚集過程（圖1）。該工作發(fā)現(xiàn)，隨著Aβ(1-42)/Aβ(1-40)自聚集的進(jìn)行，Tyr的電化學(xué)信號會隨之降低。導(dǎo)致Tyr電化學(xué)信號降低的原因有兩方面：一方面，Aβ(1-42)/Aβ(1-40)自聚集生成沉淀，導(dǎo)致可溶性Aβ濃度的降低；另一方面，由于Aβ(1-42)/Aβ(1-40)自聚集過程中二級結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致Tyr上電子轉(zhuǎn)移到電極表面的速率降低。因此通過對Tyr電化學(xué)信號的實(shí)時檢測可以得到Aβ自聚集的動態(tài)信息。由于Tyr的電化學(xué)信號較弱，并且在Aβ自聚集的過程中不穩(wěn)定，因此直接利用該方法篩選Aβ自聚集抑制劑有一定的困難，且容易出現(xiàn)異常結(jié)果，導(dǎo)致結(jié)論出現(xiàn)偏差[39]。

圖1 方波伏安法實(shí)時檢測Aβ(1-42)（紅色曲線）和Aβ(1-40)（藍(lán)色曲線）的自聚集過程Fig.1 Kinetic study of Aβ(1-42)(red line)and Aβ(1-40)(blue line)aggregation,using SWV.Inset:Voltammograms of native Aβ(1-42)(red line)and Aβ(1-40)(blue line)

針對該問題，F(xiàn)uente等[40]利用碳納米管修飾玻碳電極，使修飾后的電極具有更好的導(dǎo)電性，從而提高了檢測Tyr電化學(xué)信號的靈敏度和穩(wěn)定性，并實(shí)時檢測了多肽型抑制劑（LPFFD）對Aβ自聚集的抑制過程（圖2）。該研究發(fā)現(xiàn)，Aβ自聚集時，產(chǎn)生的聚集物會導(dǎo)致溶液中Tyr電化學(xué)信號的降低。而LPFFD可有效抑制Aβ聚集物的形成、降解已經(jīng)形成的Aβ聚集物，使溶液中Tyr的電化學(xué)信號升高。基于此種原理，該方法可以用于篩選Aβ自聚集的多肽型抑制劑。

圖2 LPFFD降解Aβ聚集物的電化學(xué)檢測圖（插圖：電鏡檢測）Fig.2 Disaggregation of Aβ(1-42)by LPFFD.Aβ(1-42)was allowed to aggregate at 28℃until the electrochemical signal was undetectable.Afterwards,the solution was incubated in the presence(■)or absence(◇)of LPFFD at roomtemperature

全長的Aβ(1-42)/Aβ(1-40)價格昂貴，利用其進(jìn)行Aβ自聚集抑制劑的篩選成本較高，不適合大規(guī)模的篩選。另外，Tyr處于Aβ(1-42)的第十位，在Aβ聚集物的外側(cè)，并不包裹在Aβ聚集物中[41]，因此直接檢測Tyr的電化學(xué)信號并不能真實(shí)的反應(yīng)抑制劑對Aβ自聚集過程的抑制作用。為了避免這個問題，Kraatz課題組在金電極上組裝Aβ自聚集片段（Aβ(12-28)），利用電化學(xué)阻抗法進(jìn)行Aβ自聚集抑制劑的篩選[42]（圖3）。該研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Aβ自聚集抑制劑與Aβ緊密結(jié)合時，金電極表面被抑制劑和Aβ的絡(luò)合物緊密包裹，溶液中鐵氰化鉀離子較難擴(kuò)散到達(dá)電極表面，從而引起電極阻抗值增大；與之相反，Aβ纖維的熒光指示劑（剛果紅）可以插入Aβ分子之間，使Aβ分子間的空隙增大、溶液中離子容易滲透到電極表面，從而導(dǎo)致檢測到的電極阻抗值降低?；谶@種原理，通過檢測電極阻抗值的大小就可以快速、簡便的篩選出Aβ自聚集抑制劑。該種方法縮短了Aβ的序列，使篩選Aβ自聚集抑制劑的成本得到了降低。但是要將Aβ片段組裝在金電極表面，需要對Aβ片段進(jìn)行修飾，并且步驟冗雜。

圖3 金電極上修飾的Aβ(12-28)與β-折疊阻斷肽（BSB）結(jié)合后的電極阻抗值（藍(lán)色曲線），與剛果紅（CR）結(jié)合后的電極阻抗值（紅色曲線）Fig.3 Faradic impedance spectra of Aβ(12-28)peptide film interaction with β-sheet breaker(BSB)peptide(blue line)or Congo red(CR)(red line)

上述的篩選Aβ自聚集抑制劑的方法非常適合于篩選多肽型抑制劑，但是當(dāng)抑制劑自身也具有電化學(xué)信號時，上述的方法無法將溶液中被測的具有氧化還原活性的物質(zhì)（Tyr和鐵氰化鉀）和抑制劑區(qū)分開，從而使抑制劑的電化學(xué)信號影響檢測結(jié)果。

近來，Zhang等[43]利用二茂鐵（ferrocene,Fc）標(biāo)記的Aβ自聚集片段（Fc-KLVFFAE）模擬全長Aβ自聚集的過程。Fc的引入，大大提高了Aβ自聚集片段的電化學(xué)信號，使電化學(xué)檢測更容易進(jìn)行。同時，該工作利用高效液相色譜與電化學(xué)聯(lián)用技術(shù)（HPLC-EC）檢測了小分子抑制劑——姜黃素對Aβ（Fc-KLVFFAE）自聚集過程的抑制作用。由于姜黃素含有酚羥基，具有電化學(xué)活性，因此利用常規(guī)的、直接的電化學(xué)方法并不能檢測到其抑制Fc-KLVFFAE自聚集的過程。因此HPLC的引入，可將Fc-KLVFFAE與姜黃素有效的分離，再利用恒電位法檢測溶液中可溶性的Fc-KLVFFAE的電化學(xué)信號，就可實(shí)時檢測姜黃素抑制Fc-KLVFFAE自聚集的過程（圖4）[43]。該方法可用于篩選具有電化學(xué)活性的Aβ自聚集抑制劑。

圖4 電化學(xué)方法檢測不同時間內(nèi)Fc-KLVFFAE溶液（a）和Fc-KLVFFAE/姜黃素混合溶液中（b）可溶性Fc-KLVFFAE的濃度Fig.4 Variations of Fc-KLVFFAE concentrations in solutions of Fc-KLVFFAE(curve a)and a Fc-KLVFFAE/curcumin mixture(curve b)over different incubation times

3 結(jié)語

近年來，隨著AD患者的增多，AD病的治療藥物逐漸受到人們的關(guān)注。作為潛在的治療AD病的藥物——Aβ自聚集抑制劑，其研究也受到AD研究領(lǐng)域的重視。由于小分子化合物和多肽抑制劑數(shù)量眾多，快速、簡便的篩選Aβ自聚集抑制劑的方法也不斷涌現(xiàn)出來。目前應(yīng)用較多的篩選方法是計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)、SPR技術(shù)、熒光技術(shù)、成像技術(shù)及電化學(xué)技術(shù)。電化學(xué)方法簡單、靈敏、快速，在對Aβ自聚集抑制劑的篩選中扮演著重要的角色。雖然篩選Aβ自聚集抑制劑的方法有了很大的發(fā)展，但是篩選出的抑制劑能否作為治療AD病的藥物，運(yùn)用于臨床還需要進(jìn)一步的研究和探索。

[1]Hardy J A,Higgins G A.Alzheimer's disease:the amyloid cascade hypothesis[J].Science,1992,256:184～185.

[2]Selkoe D J.Alzheimer's disease is a synaptic failure[J].Science,2002,298:789～791.

[3]Selkoe D J.The molecular pathology of Alzheimer's disease[J].Neuron,1991,6:487～498.

[4]Xu Y C,Shen J J,Luo X M,et al.Conformational transition of amyloid beta-peptide[J].Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2005,102:5 403～5 407.

[5]Irie K,Murakami K,Masuda Y,et al.Structure of betaamyloid fibrils and its relevance to their neurotoxicity:Implications for the pathogenesis of Alzheimer's disease[J].J.Biosci.Bioeng.,2005,99:437～447.

[6]Hardy J,Selkoe D J.Medicine-The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease:Progress and problems on the road to therapeutics[J].Science,2002,297:353～356.

[7]Yang F S,Lim G P,Begum A N,et al.Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils,binds plaques,and reduces amyloid in vivo[J].J.Biol.Chem.,2005,280:5 892～5 901.

[8]Soto C,Kindy M S,Baumann M,et al.Inhibition of Alzheimer's amyloidosis by peptides that prevent betasheet conformation[J].Biochem.Biophys.Res.Commun.,1996,226:672～680.

[9]Lorenzo A,Yankner B A.Amyloid fibril toxicity in Alzheimer's disease and diabetes[J].Ann.N.Y.Acad.Sci.,1996,777:89～95.

[10]Koo E H,Lansbury P T,Kelly J W.Amyloid diseases:Abnormal protein aggregation in neurodegeneration[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1999,96:9 989～9 990.

[11]Schenk D,Barbour R,Dunn W,et al.Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer disease-like pathology in the PDAPP mouse[J].Nature,1999,400:173～177.

[12]Estrada L D,Soto C.Disrupting beta-amyloid aggregation for Alzheimer disease treatment[J].Curr.Top.Med.Chem.,2007,7:115～126.

[13]Gupta S,Fallarero A,Jarvinen P,et al.Discovery of dual binding site acetylcholinesterase inhibitors identified by pharmacophore modeling and sequential virtual screening techniques[J].Bioorg.Med.Chem.Lett.,2011,21:1 105～1 112.

[14]Hawkes C A,Ng V,McLaurin J.Small molecule inhibitors of Ab aggregation and neurotoxicity[J].Drug Develop.Res.,2009,70:111～124.

[15]Diaza J C,Simakovaa O,Jacobsonb K A,et al.Small molecule blockers of the Alzheimer Aβ calcium channel potently protect neuronsfrom Aβ cytotoxicity[J].Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2009,106:3 348～3 353.

[16]Tjernberg L O,Naslund J,Lindqvist F,et al.Arrest of beta-amyloid fibril formation by a pentapeptide ligand[J].J.Biol.Chem.,1996,271:8 545～8 548.

[17]Klunk W E,Jacob R F,Mason R P.Quantifying Aβ aggregation using the Congo red Aβ(CR-Aβ)spectrophotometric assay[J].Anal.Biochem.,1999,266:66～76.

[18]Matsumura S,Shinoda K,Yamada M,et al.Two distinct amyloid beta-protein(Aβ)assembly pathways leading to oligomers and fibrils identified by combined fluorescence correlationspectroscopy,morphology,andtoxicity analyses[J].J.Biol.Chem.,2011,286:11 555～11 562.

[19]Convertino M,Vitalis A,Caflisch A.Disordered Binding of Small Molecules to Aβ(12-28)[J].J.Biol.Chem.,2011,286:41 578～41 588.

[20]Chini M G,Scrima M,Ursi A M D,et al.Fibril aggregation inhibitory activityof the β-sheet breaker peptides:a molecular docking approach[J].J.Pept.Sci.,2008,15:229～234.

[21]Cairo C W,Strzelec A,Murphy R M,et al.Affinity-based inhibition of beta-amyloid toxicity[J].Biochemistry,2002,41:8 620～8 629.

[22]Look G C,Jerecic J,Cherbavaz D B,et al.Discovery of ADDL-Targeting Small Molecule Drugs for Alzheimer's disease[J].Curr.Alzheimer Res.,2007,4:562～567.

[23]Findeis M A,Musso G M,Arico-Muendel C C,et al.Modified-PeptideInhibitorsofAmyloid-Peptide Polymerization[J].Biochemistry,1999,38:6 791～6 800.[24]Gordon D J,Sciarretta K L,Meredith S C.Inhibition of beta-amyloid(40)fibrillogenesis and disassembly of beta-amyloid(40)fibrils by short beta-amyloid congeners containing N-methyl amino acids at alternate residues[J].Biochemistry,2001,40:8 237～8 245.

[25]Stine W B,Dahlgren K N,Krafft G A,et al.In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis[J].J.Biol.Chem.,2003,278:11 612～11 622.

[26]Zhang L,Yagnik G,Peng Y,et al.Kinetic studies of inhibitionoftheAβ(1-42)aggregationusinga ferrocene-tagged β-sheet breaker peptide[J].Anal.Biochem.,2013,434:292～299.

[27]Stempler S,Levy-Sakin M,Frydman-Marom A,et al.Quantitative structure–activity relationship analysis of β-amyloid aggregation inhibitors[J].J.Comput.Aided.Mol.Des.,2011,25:135～144.

[28]Karlsson D,Fallarero A,Brunhofer G,et al.Identification andcharacterizationofdiarylimidazolesashybrid inhibitors of butyrylcholinesterase and amyloid beta fibril formation[J].Eur.J.Pharm.Sci.,2012,45:169～183.

[29]Cheng X R,Sze Hung V W,Scarano S,et al.Label-free methods for probing the interaction of clioquinol with amyloid-β[J].Anal.Methods,2012,4:2 228～2 232.

[30]Chen J,Armstrong A H,Koehler A N,et al.Small MoleculeMicroarraysEnabletheDiscoveryof Compounds That Bind the Alzheimer's A beta Peptide and Reduce its Cytotoxicity[J].J.Am.Chem.Soc.,2010,132:17 015～17 022.

[31]Reinke A A,Gestwicki J E.Insight intoAmyloid Structure Using Chemical Probes[J].Chem.Biol.Drug Des.,2011,77:399～411.

[32]Santo R D,Costi R,Crucitti G C,et al.Design,Synthesis,andStructure-ActivityRelationshipofNArylnaphthylamine Derivatives as Amyloid Aggregation Inhibitors[J].J.Med.Chem.,2012,55:8 538～8 548.

[33]Lambert M P,Barlow A K,Chromy B A,et al.Diffusible,nonfibrillar ligands derived from Aβ(1-42)are potent central nervous system neurotoxins[J].Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1998,95:6 448～6 453.

[34]Poduslo J F,Howell K G,Olson N C,et al.Alzheimer's Disease Amyloid β-Protein Mutations and Deletions That Define Neuronal Binding/Internalization as Early Stage Nonfibrillar/Fibrillar Aggregates and Late Stage Fibrils[J].Biochemistry,2012,51:3 993～4 003.

[35]Li H,Xie H,Cao Y,et al.A General Way to Assay Protein by Coupling Peptide with Signal Reporter via SupermoleculeFormation[J].Anal.Chem.,2013,85:1 047～1 052.

[36]Zhang B,Cheng X R,da Silva I S,et al.Electroanalysis of the interaction between(-)-epigallocatechin-3-gallate(EGCG)and amyloid-β in the presence of copper[J].Metallomics,2013,5:259～264.

[37]Loksztejna A,Dzwolak W,Krysiński P.Tyrosine side chains as an electrochemical probe of stacked β-sheet protein conformations[J].Bioelectrochemistry,2008,72:34～40.

[38]Vestergaard M,Kerman K,Saito M,et al.A rapid labelfree electrochemical detection and kinetic study of Alzheimer's amyloid beta aggregation[J].J.Am.Chem.Soc.,2005,127:11 892～11 893.

[39]Veloso A J,Kerman K.Modulation of fibril formation by a beta-sheet breaker peptide ligand:An electrochemical approach[J].Bioelectrochemistry,2012,84:49～52.

[40]Fuente E,Adura C,Kogan M J,et al.Carbon Nanotubes Electrochemistry Allows the In Situ Evaluation of the Effect of β-Sheet Breakers on the Aggregation Process of β-Amyloid[J].Electroanal.,2012,24:938～944.

[41]Kheterpal I,Williams A,Murphy C,et al.Structural features of the A beta amyloid fibril elucidated by limited proteolysis[J].Biochemistry,2001,40:11 757～11 767.

[42]Partovi-Nia R,Beheshti S,Qin Z,et al.Study of Amyloid β-Peptide(Aβ12-28-Cys)Interactions with Congo Red and β-Sheet Breaker Peptides Using Electrochemical ImpedanceSpectroscopy[J].Langmuir,2012,28:6 377～6 385.

[43]Zhang L,Kai T,Sun Z,et al.A Ferrocene-Tagged Amy loid-β Fragment for Rapid Screening of Aggregation InhibitorsfromNaturalCompoundsbyHPLCElectrochemicalDetection[J].Electroanal.,2013,25:1 659～1 664.