陳 珂，劉鳳娟，易 姿*，楚 霞

（1.湖南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410081）

（2.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410082）

目標(biāo)物誘導(dǎo)的等離子激元耦合以及表面增強(qiáng)拉曼光譜用于牛奶中三聚氰胺的檢測(cè)

陳 珂1，劉鳳娟2，易 姿2*，楚 霞2

（1.湖南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410081）

（2.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410082）

該文報(bào)道了一種基于目標(biāo)物誘導(dǎo)的等離子激元耦合以及表面增強(qiáng)拉曼光譜、利用未修飾的金納米顆粒檢測(cè)牛奶中三聚氰胺的新穎、免標(biāo)記、易操作的納米生物傳感方法。三聚氰胺與聚T寡核苷酸的結(jié)合使得金納米顆粒不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致鹽誘導(dǎo)的單分散金納米顆粒發(fā)生團(tuán)聚。而團(tuán)聚的金納米顆粒能夠產(chǎn)生等離子激元耦合，并引發(fā)了表面拉曼信號(hào)的增強(qiáng)。該方法不僅在設(shè)計(jì)上簡(jiǎn)單、直接，而且在具體實(shí)驗(yàn)操作中也是非?？焖俸头奖愕?。該方法能夠在實(shí)際牛奶樣品中檢測(cè)三聚氰胺，檢測(cè)限為8 nmol/L。

三聚氰胺；表面增強(qiáng)拉曼光譜；牛奶；納米生物傳感器

0 引言

三聚氰胺（1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺）是一種三嗪類(lèi)含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，它作為一種工業(yè)化學(xué)品，廣泛應(yīng)用于塑料、造紙、紡織、涂料、木材加工等行業(yè)。由于其含氮量高（66%）和成本低的特性[1]，它經(jīng)常會(huì)被不法商販添加到食品中來(lái)提高蛋白質(zhì)的含量。近年來(lái)，因食用添加了三聚氰胺的奶制品而導(dǎo)致嬰幼兒中毒死亡的嚴(yán)重事故已經(jīng)引起了全世界的關(guān)注。如今，許多國(guó)家已經(jīng)對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物食物中的三聚氰胺含量實(shí)行了監(jiān)管和限制[2~3]。因此，目前急切需要發(fā)展一種簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)高效和高靈敏度的技術(shù)用于三聚氰胺的檢測(cè)。

一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)質(zhì)譜法（MS）[4~6]、色譜法[7]、毛細(xì)管電泳法（CE）[8~9]、化學(xué)發(fā)光法[10~11]、電化學(xué)[12~13]或酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[14~15]，都可以對(duì)食品中的三聚氰胺進(jìn)行分析。在這些方法中，質(zhì)譜法是檢測(cè)三聚氰胺的最好方法，具有較高的靈敏度和特異性。然而，由于食品是一個(gè)典型的復(fù)雜基質(zhì)樣品，當(dāng)檢測(cè)食品中的三聚氰胺時(shí)，傳統(tǒng)的質(zhì)譜法通常需要預(yù)先進(jìn)行較多步驟、較為繁瑣的樣品處理，并且由于需要利用分離技術(shù)（例如氣相色譜法、液相色譜法以及毛細(xì)管電泳法等）來(lái)對(duì)基質(zhì)進(jìn)行分離，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程是非常耗時(shí)的?？偟膩?lái)說(shuō)，這些傳統(tǒng)的檢測(cè)方法對(duì)于快速檢測(cè)大量奶制品中的三聚氰胺含量并不合適。

表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）是一種超靈敏的振動(dòng)光譜檢測(cè)方法，它在納米基底上檢測(cè)樣品能達(dá)到十億分之一的水平，甚至達(dá)到單個(gè)分子水平的檢測(cè)限[16~18]。由于其光譜的高特異性、理想的響應(yīng)速度以及較好的光穩(wěn)定性，表面增強(qiáng)拉曼散射方法在構(gòu)建一個(gè)快速、方便、靈敏、具體的樣品測(cè)定的傳感器方面，得到了相當(dāng)大的關(guān)注。最近，有研究表明，兩個(gè)或多個(gè)金屬納米顆粒之間的納米間隙與“拉曼熱點(diǎn)”之間是相互聯(lián)系的，而且當(dāng)顆粒之間的間隙距離減小時(shí)，SERS強(qiáng)度會(huì)大大地增強(qiáng)[19~20]。也就是說(shuō)，表面增強(qiáng)拉曼散射信號(hào)可以通過(guò)顆粒間的等離激元耦合電磁場(chǎng)的加強(qiáng)來(lái)得以調(diào)整。因?yàn)檫@種機(jī)制能夠在維持高靈敏度的情況下進(jìn)行簡(jiǎn)單的均相測(cè)定實(shí)驗(yàn)，因此，它在納米傳感器的發(fā)展方面也是一個(gè)極為理想的選擇，例如，DNA的檢測(cè)、酶控制的組裝以及pH響應(yīng)的聚合物構(gòu)象變換等都可以使用這種方法。

在該文中，為了簡(jiǎn)化檢測(cè)三聚氰胺的步驟并提高檢測(cè)靈敏度，該文課題組設(shè)計(jì)了一種新型的納米傳感器，這種傳感器是通過(guò)使用表面增強(qiáng)拉曼光譜的檢測(cè)方法來(lái)對(duì)三聚氰胺進(jìn)行檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，三聚氰胺能夠通過(guò)氫鍵選擇性地與聚胸腺嘧啶（poly T）寡核苷酸結(jié)合。這一現(xiàn)象使得該文課題組構(gòu)建出一種通過(guò)控制DNA保護(hù)的金納米顆粒之間的等離激元耦合來(lái)高靈敏檢測(cè)三聚氰胺的方法。在目標(biāo)物控制的等離子激元耦合以及表面增強(qiáng)拉曼光譜轉(zhuǎn)導(dǎo)的基礎(chǔ)上，這種新型的納米傳感器展現(xiàn)了相當(dāng)高的靈敏性和特異性，三聚氰胺在實(shí)際液體牛奶樣品中可以檢測(cè)到的下限為8 nmol/L，并且具有很寬的線(xiàn)性響應(yīng)范圍。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

三聚氰胺（純度≥99%）購(gòu)自上海百靈威化學(xué)有限公司，不需要進(jìn)一步的純化。氯金酸（HAuCl4）、結(jié)晶紫 （CV）、檸檬酸鈉、KH2PO4、Na2HPO4和NaCl均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。無(wú)標(biāo)記的、含有24個(gè)胸腺嘧啶的聚T寡核苷酸是由大連寶生物有限公司合成。所有試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)中所用的超純水由Millipore Milli-Q純水凈化儀（Billerica，MA，USA）獲得（電阻值大于18.3 MΩ），并經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌處理。

實(shí)驗(yàn)使用激光共聚焦顯微拉曼儀（RamLab-010，Jobin Yvon，法國(guó)）進(jìn)行拉曼檢測(cè)。儀器包括一個(gè)內(nèi)置的Olympus BX40顯微鏡和一個(gè)50倍的物鏡。實(shí)驗(yàn)中所用的He-Ne發(fā)射激光波長(zhǎng)是632.8 nm，能量約為5 mW，光譜分辨率為2 cm-1，曝光時(shí)間為10 s。拉曼儀器的狹縫寬度和共軛孔大小分別設(shè)置為100 μm和1 000 μm。紫外吸收光譜的檢測(cè)是利用UV-2450（Shimadzu，Japan）紫外分光光度計(jì)測(cè)得。透射電子顯微鏡（TEM）成像圖是由高清晰度2100F透射電子顯微鏡（JEOL，Japan）獲得的，加速電壓為200 kV。TEM分析樣品的準(zhǔn)備過(guò)程如下：將4 μL的樣品溶液滴在碳膜覆蓋的銅網(wǎng)上，然后在室溫下自然晾干。

1.2 金納米顆粒的制備

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[21~22]，檸檬酸根保護(hù)的金納米顆粒是通過(guò)檸檬酸鈉還原氯金酸制備而成的。首先，實(shí)驗(yàn)中所用的玻璃器皿都浸泡在新配置的HNO3∶HCl=1∶3（V/V）溶液中，在使用前用超純水沖洗干凈后在空氣中干燥。對(duì)于合成直徑約為30 nm的金納米顆粒，將100 mL，0.49 mmol/L的氯金酸溶液在500 r/min的轉(zhuǎn)速下攪拌加熱至沸騰，然后迅速加入2.3 mL，0.039 mol/L的檸檬酸鈉溶液，幾分鐘后，溶液的顏色由淺黃色變成深紅色，繼續(xù)加熱回流30 min，然后讓其自然冷卻至室溫，再放在4℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。合成好的金納米顆粒會(huì)在530 nm處出現(xiàn)最大紫外吸收值，按照之前文獻(xiàn)報(bào)道的方法，不同尺寸的金納米顆粒是通過(guò)調(diào)節(jié)檸檬酸鈉溶液的濃度來(lái)制備的[22~25]。

1.3 吸附了拉曼活性染料和聚T寡核苷酸的金納米顆粒溶液的制備

無(wú)標(biāo)記的聚T寡核苷酸和拉曼活性染料結(jié)晶紫（CV）是通過(guò)靜電吸附覆蓋在金納米顆粒表面的。簡(jiǎn)要的說(shuō)，將3 μL，10 μmol/L的聚T寡核苷酸，10 μL，10 μmol/L的 CV以及 10 μL，10 mmol/L的PB（pH7.4）緩沖液加入到50 μL約為1 nmol/L的金納米顆粒溶液中，并在37℃下孵育20 min。

1.4 SERS檢測(cè)三聚氰胺

將10 μL不同濃度的三聚氰胺樣品溶液加入73 μL吸附了CV和聚T寡核苷酸的金納米顆粒反應(yīng)溶液中，然后在室溫下孵育20 min。最后在反應(yīng)后的混合溶液中加入8 μL，125 mmol/L的NaCl溶液和9 μL的H2O（使得最終總體積為100 μL），并立即進(jìn)行SERS檢測(cè)。

1.5 實(shí)際牛奶樣品的檢測(cè)

實(shí)際牛奶樣品的處理方法是參考文獻(xiàn)[26]并加以修改得到的。首先取6 mL市售的液體牛奶與1.8 μL三氯乙酸溶液混合，并孵育2 min將樣品基質(zhì)中的蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)。然后將混合物進(jìn)行離心處理（10 000 r/min，5 min），再將離心后的上清液移至另一個(gè)離心管中用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7。對(duì)上清液重復(fù)離心操作兩次后，加入一定量的三聚氰胺，最后所得到的濾液用SERS納米傳感器進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 SERS方法檢測(cè)三聚氰胺的基本原理

該文設(shè)計(jì)了一種新型的檢測(cè)三聚氰胺的納米傳感器，它是基于目標(biāo)物誘導(dǎo)的等離子耦合以及表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）來(lái)對(duì)三聚氰胺進(jìn)行檢測(cè)的。圖1描述了這種SERS納米傳感器檢測(cè)三聚氰胺的基本原理。這種納米傳感器是利用三聚氰胺控制金納米顆粒的穩(wěn)定性，使得金納米顆粒發(fā)生團(tuán)聚，同時(shí)產(chǎn)生等離激元耦合感應(yīng)以及SERS傳導(dǎo)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的。

圖1 目標(biāo)誘導(dǎo)的等離激元偶合及表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)三聚氰胺的原理圖Fig.1 Schematic illustration of the melamine sensing strategy based on target-controlled interparticle plasmon coupling and surface enhanced Raman scattering transduction

首先，通過(guò)靜電吸附作用，聚T寡核苷酸和拉曼活性染料混合吸附在金納米顆粒的表面。聚T寡核苷酸吸附到金納米顆粒表面后，它的負(fù)電荷能夠保證金納米顆粒很好的分散在反應(yīng)混合溶液中，并且保護(hù)金納米顆粒在鹽離子的誘導(dǎo)下不發(fā)生團(tuán)聚。而三聚氰胺又能控制吸附了聚T寡核苷酸和拉曼活性染料的單分散金納米顆粒，當(dāng)三聚氰胺存在時(shí)，它能與聚T寡核苷酸在水介質(zhì)中形成三重氫鍵，降低了金納米顆粒表面的負(fù)電荷，從而導(dǎo)致金納米顆粒不穩(wěn)定，在加入NaCl溶液后，金納米顆粒會(huì)發(fā)生團(tuán)聚，拉曼信號(hào)增強(qiáng)。其結(jié)果是由于金納米顆粒粒子表面電磁場(chǎng)的顯著增強(qiáng)，粒子間產(chǎn)生強(qiáng)的表面等離激元耦合而引發(fā)的。因?yàn)槟繕?biāo)物三聚氰胺能夠?qū)Ⅺ}誘導(dǎo)的金納米顆粒團(tuán)聚控制在一個(gè)單步的過(guò)程中，因此，這就為三聚氰胺的檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單、快速、高靈敏和高特異性的方法。

2.2 SERS檢測(cè)三聚氰胺的拉曼光譜及其對(duì)應(yīng)的紫外吸收光譜

為了考察三聚氰胺檢測(cè)的可行性，該文課題組進(jìn)行了一系列的控制實(shí)驗(yàn)。如圖2A所示，這是利用結(jié)晶紫（CV）作為拉曼報(bào)告分子對(duì)三聚氰胺進(jìn)行SERS檢測(cè)所得到的拉曼光譜圖。吸附了CV的金納米顆粒能夠很好的分散在水溶液中，呈現(xiàn)紅色，并且會(huì)產(chǎn)生一個(gè)非常弱的SERS信號(hào)（曲線(xiàn)a），這就意味著金納米顆粒粒子間的距離太遠(yuǎn)以至于不能誘發(fā)粒子間的等離子激元耦合。當(dāng)加入20 mmol/L的NaCl后，該溶液迅速褪色，最后幾乎變?yōu)闊o(wú)色的，這就是一個(gè)典型的金納米顆粒的團(tuán)聚現(xiàn)象。此外，在該反應(yīng)溶液中能檢測(cè)到一個(gè)顯著增強(qiáng)的拉曼信號(hào)（曲線(xiàn)b），這對(duì)于說(shuō)明粒子間等離激元耦合引起的SERS信號(hào)增強(qiáng)是伴隨著金納米顆粒的團(tuán)聚而產(chǎn)生的，提供了一個(gè)非常明顯的證據(jù)。

圖2 （A）不同情況下所得到的拉曼光譜圖，其中：（a）Au NPs+CV；（b）Au NPs+CV+NaCl；（c）Au NPs+ CV+DNA+NaCl；（d）Au NPs+CV+DNA+三聚氰胺+NaCl；（B）圖（A）中相對(duì)應(yīng)體系的紫外吸收光譜圖，插圖為對(duì)應(yīng)體系的照片F(xiàn)ig.2 Typical SERS(A)and UV-vis absorption(B)spectra obtained in melamine assay:(a)AuNPs+CV;(b) AuNPs+CV+NaCl;(c)AuNPs+CV+NaCl+DNA;(d)AuNPs+CV+NaCl+DNA+melamine.The inset is the photograph of the corresponding systems.The concentrations of NaCl,DNA,CV and melamine are 20 mmol/L,300 nmol/L,0.1 μmol/L and 10 μmol/L,respectively

在進(jìn)行三聚氰胺檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，當(dāng)不存在三聚氰胺的情況下，加入20 mmol/L的NaCl溶液，吸附了聚T寡核苷酸和CV的金納米顆粒的顏色沒(méi)有明顯的變化，SERS信號(hào)也并沒(méi)有得到增強(qiáng)（曲線(xiàn)c），這就說(shuō)明聚T寡核苷酸能夠保護(hù)金納米顆粒穩(wěn)定地存在于鹽溶液中，從而抑制了粒子間的等離激元耦合的發(fā)生。與此相反，當(dāng)目標(biāo)物三聚氰胺與吸附了聚T寡核苷酸和CV的金納米顆粒孵育20 min后，加入NaCl溶液，溶液顏色由紅色褪色至接近無(wú)色，這表明金納米顆粒發(fā)生團(tuán)聚，并且發(fā)生了粒子間的表面等離激元耦合，使得SERS信號(hào)得到非常大的增強(qiáng)（曲線(xiàn)d）。

圖2B所描述的是為與上述情況相對(duì)應(yīng)的紫外吸收光譜圖，當(dāng)金納米顆粒發(fā)生團(tuán)聚、SERS強(qiáng)度大大增加時(shí)，伴隨的是所對(duì)應(yīng)紫外光譜的擴(kuò)寬和紅移（見(jiàn)圖2B中曲線(xiàn)b和d）；相反，當(dāng)金納米顆粒很好的分散在溶液中，不發(fā)生SERS信號(hào)增強(qiáng)時(shí)，紫外吸收光譜則會(huì)在530 nm處出現(xiàn)一個(gè)很強(qiáng)的表面等離激元共吸收振峰 （見(jiàn)圖2B中曲線(xiàn)a和c）。

透射電子顯微鏡（TEM）成像圖（如圖3所示）進(jìn)一步描述了該方法用于三聚氰胺實(shí)驗(yàn)時(shí)金納米顆粒的狀態(tài)，在沒(méi)有三聚氰胺存在下，金納米顆粒呈分散狀態(tài)，在有三聚氰胺存在下，金納米顆粒則呈現(xiàn)團(tuán)聚狀態(tài)。在實(shí)驗(yàn)中，由于等離激元耦合引起的SERS增強(qiáng)對(duì)聚T寡核苷酸與三聚氰胺的結(jié)合具有很高的特異性，而且僅需簡(jiǎn)單地將分析物和反應(yīng)緩沖液相混合，并且孵育不超過(guò)20 min，因此，這種生物傳感器方法提供了在均相中免標(biāo)記檢測(cè)三聚氰胺的一個(gè)簡(jiǎn)單、快速和高特異性的平臺(tái)。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

粒子間的等離激元耦合在很大程度上決定于金屬顆粒的大小、形狀以及拉曼染料和聚T寡核苷酸的濃度。為了優(yōu)化這些實(shí)驗(yàn)條件，利用發(fā)生等離激元耦合的金納米顆粒團(tuán)聚體產(chǎn)生的SERS強(qiáng)度與沒(méi)有發(fā)生等離激元耦合的單分散金納米顆粒產(chǎn)生的SERS強(qiáng)度的比值來(lái)進(jìn)行考察。這項(xiàng)考察手段反應(yīng)了在有和沒(méi)有三聚氰胺存在的情況下SERS響應(yīng)強(qiáng)度之間的對(duì)比。圖4描述了不同粒徑的金納米顆粒對(duì)SERS響應(yīng)的影響。從圖中可以看出，較大尺寸的金納米顆粒在電磁場(chǎng)中表現(xiàn)出較好的SERS增強(qiáng)效果，但是粒徑為60 nm的金納米顆粒與粒徑為30 nm的金納米顆粒相比較，僅呈現(xiàn)出非常微弱的優(yōu)勢(shì)。并且聚T寡核苷酸濃度很高的情況下，粒徑為60 nm的金納米顆粒在鹽溶液中的穩(wěn)定性并沒(méi)有30 nm的金納米顆粒在鹽溶液中的穩(wěn)定性好。所以，選擇30 nm的金納米顆粒用于所構(gòu)建的傳感器。

圖3 不同情況下的透射電子顯微鏡圖（TEM）：（A）不存在三聚氰胺時(shí)；（B）存在三聚氰胺時(shí)Fig.3 TEM images of polythymine-stabilized AuNPs in the absence(A)or presence of(B)10 μmol/L melamine

圖4 金納米顆粒尺寸大小的優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)中NaCl、聚T寡核苷酸、CV和三聚氰胺的濃度分別為：20 mmol/L、300 nmol/L、0.1 μmol/L和10 μmol/L。誤差棒是四次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig.4 Dependency of SERS intensity ratio values on the size of AuNPs.The concentrations of NaCl,polythymine, CV,and melamine were 20 mmol/L,300 nmol/L,0.1 μmol/L,and 10 μmol/L,respectively.Error bars are standard deviation of three repetitive experiments

另外，對(duì)CV的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。從圖5A中可以看到，當(dāng)CV的濃度為0.1 μmol/L時(shí)，SERS強(qiáng)度的比值能夠達(dá)到最大。然而，較高濃度的CV會(huì)導(dǎo)致SERS強(qiáng)度的減小，其主要原因是，當(dāng)三聚氰胺加入時(shí)，高濃度的拉曼報(bào)告分子會(huì)阻礙單鏈DNA很好的保護(hù)金納米顆粒，并且導(dǎo)致金納米顆粒的團(tuán)聚。因此，選擇0.1 μmol/L為最佳的CV濃度用于該傳感器中。最后，聚T寡核苷酸濃度的優(yōu)化也是非常重要的。選擇含有24個(gè)胸腺嘧啶的聚T寡核苷酸用于該傳感器。圖5B是聚T寡核苷酸的濃度與SERS響應(yīng)的關(guān)系圖。從圖中可以看出，聚T寡核苷酸的濃度太低，則不能很好的保護(hù)金納米顆粒，而聚T寡核苷酸的濃度過(guò)高，則會(huì)導(dǎo)致金納米顆粒無(wú)法團(tuán)聚從而背景信號(hào)過(guò)高。因此，選擇能夠?qū)崿F(xiàn)SERS最大強(qiáng)度的300 nmol/L的聚T寡核苷酸濃度來(lái)用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中。

2.4 SERS方法檢測(cè)三聚氰胺的工作曲線(xiàn)

在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)SERS方法檢測(cè)三聚氰胺的靈敏性進(jìn)行了考察。圖6描述了目標(biāo)物三聚氰胺在不同濃度下的SERS強(qiáng)度響應(yīng)。從圖中可以看出，隨著三聚氰胺的濃度增加，SERS的峰強(qiáng)度也逐漸增加，這表明，在高濃度的目標(biāo)物存在下，金納米顆粒會(huì)發(fā)生團(tuán)聚且發(fā)生了增強(qiáng)的等離激元耦合。在0.01 μmol/L到10 μmol/L的三聚氰胺檢測(cè)濃度范圍內(nèi)，1 612 cm-1處的SERS峰面積與三聚氰胺的濃度是呈線(xiàn)性關(guān)系的，根據(jù)空白響應(yīng)的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差準(zhǔn)則，估算三聚氰胺的檢測(cè)下限為4.5 nmol/L。如此低的檢測(cè)下限明顯的優(yōu)于現(xiàn)有的檢測(cè)三聚氰胺的方法[1,11~12]，這就表明所設(shè)計(jì)的傳感器具有非常高的靈敏性。

圖5 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化：（A）不同濃度的CV對(duì)SERS強(qiáng)度比值的影響；（B）不同濃度的聚T寡核苷酸對(duì)SERS強(qiáng)度的影響。誤差棒是四次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig.5 Dependency of SERS intensity ratio values on the concentrations of CV(A)and polythymine(B).The concentrations of NaCl and Melamine were 20 mmol/L and 10 μmol/L,respectively.Error bars are standard deviation of three repetitive experiments

圖6 （A）在不同濃度三聚氰胺存在下產(chǎn)生的SERS光譜圖；（B）1 612 cm-1處SERS峰面積與三聚氰胺濃度的關(guān)系圖。三聚氰胺的濃度從a到i分別是：0 μmol/L,0.01 μmol/L,0.5 μmol/L,1 μmol/L,2 μmol/L, 4 μmol/L,6 μmol/L,8 μmol/L and 10 μmol/L。誤差棒是四次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig.6 (A)Typical Raman spectra of the nanosensor in response to melamine of varying concentrations.(B)Raman peak areas at 1 612 cm-1versus different melamine concentrations.The concentrations of melamine are(from a to i), respectively.The error bars indicate the standard deviations of three independent experiments

2.5 選擇性的考察

對(duì)于傳感器性能的考察，選擇性是除了靈敏性以外的另一個(gè)重要考察因素，特別是在傳感器實(shí)際樣品的檢測(cè)中，目標(biāo)物對(duì)于其它潛在競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的高選擇性是非常有必要的。因此，該文課題組所擬建的SERS納米傳感器的選擇性實(shí)驗(yàn)將在三聚氰胺的類(lèi)似物以及牛奶中常見(jiàn)的離子和輔料中進(jìn)行。圖7A是三聚氰胺和其它干擾物質(zhì)的SERS響應(yīng)光譜圖，圖7B是各種干擾物質(zhì)所對(duì)應(yīng)在1 612 cm-1處的SERS峰面積的柱狀圖，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，所選擇的十四種干擾物質(zhì)用于該傳感器幾乎檢測(cè)不到任何表面增強(qiáng)拉曼散射信號(hào)。這就表明，該文課題組所設(shè)計(jì)的納米傳感器方法來(lái)檢測(cè)三聚氰胺具有很高的選擇性。

2.6 實(shí)際牛奶樣品中三聚氰胺的檢測(cè)

圖8 （A）在不同濃度三聚氰胺存在于實(shí)際牛奶樣品中產(chǎn)生的SERS光譜圖；（B）1 612 cm-1處SERS峰面積與實(shí)際牛奶樣品中三聚氰胺濃度的關(guān)系圖，誤差棒是四次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig.8 (A)Typical Raman spectra of the nanosensor in response to melamine of varying concentrations in real liquid milk samples.(B)Raman peak areas at 1 612 cm-1versus different melamine concentrations.The concentrations of melamine are 0 μmol/L,0.1 μmol/L,1 μmol/L,5 μmol/L,8 μmol/L and 10 μmol/L(from a to f),respectively.The error bars indicate the standard deviations of three independent experiments

最后，考察了該納米傳感器在實(shí)際應(yīng)用中的可行性，該文課題組從超市購(gòu)買(mǎi)液體牛奶，并將不同濃度的三聚氰胺加入到處理后的牛奶中進(jìn)行SERS檢測(cè)。正如預(yù)期的那樣，表面增強(qiáng)拉曼光譜峰強(qiáng)度會(huì)隨著牛奶中加入三聚氰胺濃度的增大而增強(qiáng)。如圖8中所示，在0.01 μmol/L到10 μmol/L的三聚氰胺檢測(cè)濃度范圍內(nèi)，1 612 cm-1處的SERS峰面積與三聚氰胺的濃度是呈線(xiàn)性關(guān)系的，根據(jù)空白響應(yīng)的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差準(zhǔn)則，估算的三聚氰胺的檢測(cè)下限為8 nmol/L。這個(gè)檢測(cè)下限比法律所規(guī)定的牛奶中三聚氰胺的含量還要低三個(gè)數(shù)量級(jí)（中國(guó)和FDA規(guī)定的嬰幼兒配方奶粉中三聚氰胺的含量為7.9 μmol/L，其他奶制品中三聚氰胺的含量為 19.75 μmol/L，歐盟委員會(huì)規(guī)定奶制品中三聚氰胺的含量為19.75 μmol/L）[1~2]。此外，基于該納米傳感器的均相分析模式，該傳感器具有非常好的重現(xiàn)性。

對(duì)含有0.1 μmol/L、1 μmol/L、8 μmol/L和10 μmol/L的三聚氰胺樣品分別進(jìn)行了三次重復(fù)測(cè)定，得到1 612 cm-1處的拉曼峰值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.0%、2.5%、0.8%、0.7%和1.6%。同樣，通過(guò)對(duì)三聚氰胺回收率的測(cè)定，對(duì)該傳感器檢測(cè)三聚氰胺的準(zhǔn)確度進(jìn)行了考察。如表1所示，含有四個(gè)不同濃度的三聚氰胺牛奶樣品，三聚氰胺的回收率范圍從98.7%到108%，這證明該文課題組所設(shè)計(jì)的納米傳感器在實(shí)際樣品中檢測(cè)三聚氰胺是非常可靠的。這些結(jié)果表明，該文課題組所發(fā)展的這種納米傳感器為三聚氰胺的檢測(cè)提供了一個(gè)非常理想的、簡(jiǎn)單的、靈敏度高的、可靠的平臺(tái)。

表1 牛奶樣品中三聚氰胺的回收率測(cè)定Tab.1 The performance of the developed SERS nanosensor in recovery experiments

3 結(jié)論

該文發(fā)展了一種新型的表面增強(qiáng)拉曼光譜傳感器，該傳感器是基于目標(biāo)物誘導(dǎo)的等離子激元耦合來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)三聚氰胺的檢測(cè)。三聚氰胺與聚T寡核苷酸的結(jié)合破壞了金納米顆粒在鹽溶液中的穩(wěn)定性，引起金納米顆粒發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，從而產(chǎn)生非常強(qiáng)的等離激元耦合表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)。由于目標(biāo)物誘導(dǎo)的粒子間的等離激元耦合以及表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)增強(qiáng)的高效性，該文課題組所發(fā)展的這種納米傳感器在三聚氰胺的快速檢測(cè)中具有很高的靈敏性和選擇性，并且在液態(tài)牛奶樣品中能檢測(cè)到三聚氰胺的最低檢測(cè)下限為8 nmol/L。由于這種技術(shù)使用了無(wú)標(biāo)記的金納米顆粒和單鏈DNA，并且是在均相中進(jìn)行簡(jiǎn)單的操作，因此它能夠?qū)?shù)百個(gè)樣品進(jìn)行快速、簡(jiǎn)單、高效率的檢測(cè)，在三聚氰胺的常規(guī)分析中具有相當(dāng)大潛力，并為三聚氰胺的檢測(cè)提供了一個(gè)很好的平臺(tái)。

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Target-controlled plasmonic coupling and surface enhanced raman scattering transduction for simple,rapid and highly sensitive detection of melamine in milk

Chen Ke1,Liu Feng-juan2,Yi Zi2*,Chu Xia2
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Hunan Normal University,Changsha 410081,China）
（2.State Key Laboratory of Chemo/Bio-Sensing and Chemometrics,College of Chemistry and Chemical Engineering,Hunan University,Changsha 410082,China）

We report a novel,label-free and easy-to-operation nanobiosensor strategy for melamine via targetcontrolled plasmonic coupling and surface enhanced Raman scattering(SERS)transduction by using the unmodified gold nanoparticles(Au NPs).This strategy utilizes the binding between polythymine and melamine result in the destabilization of Au NPs,and then lead to the salt-induced aggregation of monodispersed Au NPs.Finally,the aggregation of Au NPs can give rise to the plasmonic coupling and turn on the enhancement of the Raman scattering. This approach is not only straightforward and simple in design,but also fairly rapid and convenient in operation.We have demonstrated successfully the application of this strategy in the detection of melamine in real liquid milk sample with the limit of detection as low as 8 nmol/L.

melamine;SERS;milk；nanobiosensor

國(guó)家自然科學(xué)基金（21275045）、NCET-11-0121、湖南省自然科學(xué)基金（Grant 12JJ1004）課題資助

*通訊聯(lián)系人，Email：willy260@163.com