袁亞利，袁 若，柴雅琴

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

凝血酶電化學(xué)適體傳感器

袁亞利，袁 若，柴雅琴*

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

凝血酶是一種由凝血酶前體形成的絲氨酸蛋白質(zhì)水解酶，具有催化纖維蛋白元變成纖維蛋白，促進(jìn)血液凝固和調(diào)控凝血等作用，在揭示腫瘤的發(fā)生機(jī)制及作為早期診斷、療效及愈后判斷依據(jù)等方面有著非常重大的意義。由于血液中凝血酶的濃度達(dá)nmol/L，建立簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度檢測(cè)凝血酶的方法具有非常重要的意義。將SELEX技術(shù)篩選出的適體作為識(shí)別元件與電化學(xué)生物傳感器相結(jié)合構(gòu)建電化學(xué)適體傳感器，集成了適體和電化學(xué)傳感器兩方面的優(yōu)勢(shì)，既具有電化學(xué)傳感器的高靈敏度、快響應(yīng)、簡(jiǎn)單操作、低成本，又具有適體的高選擇性和特異性，在凝血酶檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。該文主要介紹了適體的體外篩選方法、適體的特點(diǎn)、適體與凝血酶的結(jié)合作用；總結(jié)了電化學(xué)適體傳感器的不同分類，捕獲探針適體的固定化方法及目前所采用的電化學(xué)分析技術(shù)；重點(diǎn)評(píng)述了電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)放大技術(shù)在電化學(xué)適體傳感器中的應(yīng)用。

電化學(xué)適體傳感器；凝血酶；納米粒子；催化信號(hào)放大

0 引言

隨著人類基因組計(jì)劃的逐漸完成以及功能基因?qū)W、蛋白組學(xué)研究的開展，尋找可靠、快速、高靈敏度的分析方法來對(duì)重要蛋白質(zhì)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量的檢測(cè)是后基因組時(shí)期一個(gè)重要的研究領(lǐng)域之一。在傳統(tǒng)檢測(cè)方法中，蛋白質(zhì)的檢測(cè)主要是利用抗體——抗原之間的特異作用。最近，基于寡核苷酸嚴(yán)格的識(shí)別及親合力而人工設(shè)計(jì)合成的寡核苷酸——適體（aptamer）的出現(xiàn)，使得傳統(tǒng)的抗體抗原反應(yīng)發(fā)生了革命性的變化。適體對(duì)蛋白質(zhì)的特異結(jié)合力與抗原抗體間的作用力相差不大，且與抗體相比較有更多的優(yōu)越性。因此利用適體構(gòu)建蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法己受到廣大科學(xué)研究者的關(guān)注。該文主要介紹了適體的體外篩選方法、適體的特點(diǎn)、適體與凝血酶的結(jié)合作用；總結(jié)了電化學(xué)適體傳感器的不同分類，捕獲探針適體的固定化方法及目前所采用的電化學(xué)分析技術(shù)；重點(diǎn)評(píng)述了電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)放大技術(shù)在電化學(xué)適體傳感器中的應(yīng)用。

1 適體概述

1.1 適體的定義

自上世紀(jì)90年代Ellington[1]和Tuerk[2]等研究小組用化學(xué)方法合成了適體并對(duì)其進(jìn)行了定義以來，適體的研究工作得到了快速發(fā)展。適體是一種通過體外篩選技術(shù)，也就是指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) （簡(jiǎn)稱 SELEX，systematic evolution of ligands by exponential enrichment）在含有大量的核酸分子庫中得到的，功能類似于單克隆抗體的，能夠與蛋白質(zhì)、小分子、離子、核酸、甚至整個(gè)細(xì)胞等目標(biāo)分子高特異性、高親和力結(jié)合的單鏈寡聚核苷酸。適體也稱為核酸適體、適配體、適配子等。它的英文名為aptamer，源于拉丁語aptus，即適合之意，可以是RNA,也可以是DNA,長(zhǎng)度一般為25~80個(gè)核苷酸[3~5]。適體與各種目標(biāo)物的高特異性結(jié)合是建立在單鏈核酸結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的多樣性基礎(chǔ)上的。它可以通過鏈內(nèi)某些互補(bǔ)堿基之間的配對(duì)以及氫鍵作用、靜電作用等發(fā)生自身適應(yīng)性的折疊，從而形成一些具有穩(wěn)定、特殊的三維空間結(jié)構(gòu)，比如G-四聚體（G-quartet）[6]、 莖-環(huán) （stem-loop）[7]、 假節(jié)（pseudoknot）[8]、發(fā)卡（hairpin）[9]等（圖1）。目前，適體被廣泛應(yīng)用于藥物檢測(cè)、生物傳感器、醫(yī)學(xué)診斷和治療等方面。

圖1 各種穩(wěn)定特殊適體的三維空間結(jié)構(gòu)Fig.1 Various stably three-dimensional structures of aptamer

1.2 適體的篩選——SELEX

SELEX技術(shù)是體外篩選aptamer的一種分子進(jìn)化工程技術(shù)，其總的構(gòu)思是從利用組合化學(xué)原理人工設(shè)計(jì)合成的大量隨機(jī)寡核苷酸庫 （約1015~1018種核酸分子）中經(jīng)過多輪重復(fù)篩選和指數(shù)富集而最終獲得具有高特異性的目標(biāo)核酸適體。核酸適體的篩選流程包括與達(dá)爾文進(jìn)化理論類似的三個(gè)過程：自發(fā)突變、自然選擇、大量增殖（圖2）。

圖2 適體的篩選流程[10]Fig.2 Schematic representation of aptamer selection procedure[10]

首先利用分子生物學(xué)技術(shù)人工構(gòu)建一個(gè)含有隨機(jī)堿基數(shù)為n的單鏈寡核苷酸文庫。由組合化學(xué)原理可知，該文庫則含4n個(gè)不同的隨機(jī)寡核苷酸序列（約為1015~1018個(gè)，因?yàn)殡S機(jī)寡核苷酸序列長(zhǎng)度一般在25～80個(gè)堿基之間）。在人工設(shè)計(jì)隨機(jī)序列時(shí)將寡核苷酸序列的兩端設(shè)計(jì)為固定序列，以便用于隨后PCR循環(huán)時(shí)結(jié)合引物，這一步就相當(dāng)于達(dá)爾文進(jìn)化論中自發(fā)突變過程。在單鏈隨機(jī)寡核苷酸與目標(biāo)物結(jié)合時(shí)，寡核苷酸可以通過氫鍵、靜電、“假堿基對(duì)”的堆積和形狀匹配等作用與目標(biāo)物形成具有很高結(jié)合力的復(fù)合物。利用這一原理可以將能與目標(biāo)物結(jié)合的寡核苷酸初步分離出來，這一步相當(dāng)于進(jìn)化過程中的自然選擇。在選擇性分離出核酸適體之后，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）及體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，生成次一級(jí)文庫，這種擴(kuò)增的過程其實(shí)就類似于達(dá)爾文進(jìn)化論中的大量增殖。為了使寡核苷酸分離相對(duì)容易一點(diǎn)，通常會(huì)在PCR過程中對(duì)其中一條鏈修飾上核糖核苷酸、生物素或有機(jī)基團(tuán)等。此外，為了得到與目標(biāo)物高特異性、高親和力結(jié)合的適體，將前面生成的次一級(jí)文庫接著再與目標(biāo)物進(jìn)行結(jié)合，反復(fù)循環(huán)多次。在每次的循環(huán)中，篩選出來的適體與目標(biāo)物的結(jié)合力都會(huì)得到提高。經(jīng)研究表明，一般情況下，循環(huán)6~15次就可以得到高特異性、高親和力的適體。而具體的循環(huán)次數(shù)最終由單鏈寡核苷酸文庫的類型以及每次循環(huán)所得到的適體富集程度來決定。只要單鏈寡核苷酸文庫足夠大，就可以為任意目標(biāo)物找到與之對(duì)應(yīng)的適體。為了實(shí)現(xiàn)篩選流程的自動(dòng)化和快速化，近年來發(fā)展了多種新型SELEX篩選技術(shù)，如毛細(xì)管電泳交聯(lián)篩選技術(shù) （CESELEX），光交聯(lián)篩選技術(shù)（photo-SELEX），自動(dòng)化篩選技術(shù)（automated-SELEX），加尾篩選技術(shù)（tailored-SELEX）， 微流控芯片篩選技術(shù)（microfluidic-SELEX）和熒光激活細(xì)胞分類篩選技術(shù)（FACS-SELEX）等。這些方法的建立，極大地提高了篩選效率，拓展了適體的應(yīng)用范圍。

1.3 適體的優(yōu)點(diǎn)

適體作為電化學(xué)傳感器的分子識(shí)別元件與其它分子識(shí)別元件相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):

（1）能與適體特異結(jié)合的目標(biāo)物種類比較廣泛：一般情況下，抗體只可與抗原結(jié)合，單鏈DNA也只能與其堿基配對(duì)的單鏈DNA結(jié)合，而對(duì)于適體，它不僅可以與較大的蛋白質(zhì)目標(biāo)物結(jié)合（如酶、抗體、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞粘附分子等），而且也可以與小分子目標(biāo)物結(jié)合（如氨基酸、金屬離子、核苷酸、生物輔因子、肽、藥物等），甚至還可以與完整的病毒顆粒、細(xì)菌和細(xì)胞等目標(biāo)物結(jié)合[11]。

（2）高特異性以及高親和力：適體對(duì)蛋白質(zhì)的高特異性結(jié)合力稍大于抗原抗體間的作用力，解離常數(shù)一般為1×10-9～1×10-12mol/L[12]。適體與目標(biāo)物高的特異性以及高親和力主要由以下原因引起的。當(dāng)適體與目標(biāo)物之外的分子相互作用時(shí)，目標(biāo)物之外的分子通常將適體上富含嘌呤的環(huán)作為外來靶序列的結(jié)合位點(diǎn)，具體表現(xiàn)為嘌呤—嘌呤排列（包括堿基錯(cuò)配、堿基三聚體和堿基平臺(tái)），因此可以在適體上看到G-G或G-A錯(cuò)配。通過這些堿基的錯(cuò)配就可以在正常雙螺旋堿基對(duì)間的堆積處產(chǎn)生一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)從而導(dǎo)致環(huán)的關(guān)閉，使得適體不與目標(biāo)物之外的分子相互作用[13]。而當(dāng)適體與目標(biāo)物結(jié)合時(shí)，單鏈核酸的結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象通常會(huì)通過鏈內(nèi)某些互補(bǔ)堿基之間的配對(duì)、靜電作用及其氫鍵作用等發(fā)生一定的適應(yīng)性折疊，從而形成穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，利于與目標(biāo)分子發(fā)生特異結(jié)合[14]。

（3）分子量較?。河捎谶m體是一段由25～80個(gè)堿基組成的單鏈寡核苷酸，因而分子量一般在8～15 KDa之間，分子量較小，有利于高密度高靈敏陣列生物傳感器的構(gòu)建。此外，還有利于穿透組織，有望直接運(yùn)用于活體分子成像和藥物傳輸。

（4）體外篩選、人工化學(xué)合成：適體是通過SELEX技術(shù)體外篩選產(chǎn)生的，不依賴于動(dòng)物或細(xì)胞，與抗體制備相比較其更簡(jiǎn)單快速、成本低。而且篩選出來的適體具有高純度，有效地消除了適體的批間差異。并且適體分子序列所定義的組合庫容量大，具備空前的多樣性，體外篩選效率高，便于進(jìn)行大規(guī)模、高通量的篩選和制備，適用于生物傳感器的大批量生產(chǎn)。

（5）穩(wěn)定性好、適合反復(fù)變性和復(fù)性：與酶和抗體/抗原相比較，適體不僅具有良好的穩(wěn)定性，而且還適合反復(fù)變性和復(fù)性，有利于重復(fù)利用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，適體制成凍干粉后可置于室溫保存長(zhǎng)達(dá)數(shù)年之久，而當(dāng)適體溶解后又立刻恢復(fù)其相應(yīng)的功能，一定程度上提高了傳感器的使用壽命和重復(fù)利用次數(shù)。

1.4 適體與凝血酶的結(jié)合作用

凝血酶是由凝血酶原活化變成的絲氨酸蛋白質(zhì)水解酶 （由49個(gè)氨基酸殘基的輕鏈和259個(gè)氨基酸殘基的重鏈組成），分子量為36 Ku。輕鏈和重鏈由二硫鍵連接，其中輕鏈對(duì)凝血酶整體結(jié)構(gòu)的完整功能性起到穩(wěn)定作用[15]，重鏈能提高催化位點(diǎn)[16]，結(jié)合陰離子，對(duì)底物發(fā)生疏水作用[17]以及穩(wěn)定凝血酶結(jié)構(gòu)[18]。凝血酶可以將催化體內(nèi)纖維蛋白元轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，在炎癥、血液凝固和創(chuàng)傷愈合等方面發(fā)揮著極其重要的作用，常用于毛細(xì)血管出血的局部止血和外科手術(shù)后組織的愈合。機(jī)體內(nèi)的凝血作用必須保持在一定的范圍內(nèi)，這是因?yàn)檫^度的凝血將會(huì)引起血栓栓塞性疾病，而且嚴(yán)重的凝血將導(dǎo)致機(jī)體死亡[19]。因此，凝血酶的濃度及活性可以作為衡量凝血機(jī)制的重要指標(biāo)之一，它對(duì)早期診斷、療效及愈后判斷具有十分重大的意義[20]。一般情況下，血液中的凝血酶濃度大約為nmol/L數(shù)量級(jí)，因此建立準(zhǔn)確、快速、高靈敏度的檢測(cè)方法和傳感器用于凝血酶的檢測(cè)在醫(yī)學(xué)上十分重要。傳統(tǒng)免疫分析法由于抗體的制備、保存等缺陷一定程度上限制了其發(fā)展。

適體對(duì)蛋白質(zhì)的特異結(jié)合力與抗原抗體間的作用力相差不大，且與抗體相比較有更多的優(yōu)越性。目前，己相繼篩出兩種與凝血酶（圖3B）不同位點(diǎn)特異性結(jié)合的適體（TBA），其中一個(gè)是結(jié)合于纖維蛋白原位點(diǎn)上的適體[1]（15個(gè)堿基：5′-GGT TGG TGT GGT TGG-3′）（圖3A），解離常數(shù)（Kd）為25~200 nmol/L，另一個(gè)是結(jié)合于凝血酶肝磷脂位點(diǎn)上的適體[21]（29個(gè)堿基： 5′-TCA GTG GGG TTG GAC GGG ATG GTG CCT GA-3′）（圖3C），其解離常數(shù)（Kd）達(dá)到0.5 nmol/L。凝血酶與適體除了有2個(gè)特異性結(jié)合位點(diǎn)外,還相對(duì)應(yīng)有2個(gè)適體[22]。利用適體與凝血酶之間高的親和力和特異性，這兩種適體己經(jīng)用于凝血酶的靈敏檢測(cè)中[21]。凝血酶適體在高離子濃度（尤其是K+）或無目標(biāo)分析物凝血酶時(shí)呈卷曲狀，而當(dāng)凝血酶出現(xiàn)時(shí)，凝血酶適體構(gòu)象逐漸由卷曲狀變?yōu)镚-四聚體結(jié)構(gòu)[23]。此時(shí)，通過適體帶負(fù)電荷的特殊G-四聚體結(jié)構(gòu)以及凝血酶?jìng)?cè)鏈上的Arg126、Lys236、Lys240和Arg93這幾個(gè)在生理?xiàng)l件下帶正電荷的氨基酸之間的相互靜電吸附作用可以將凝血酶適體與凝血酶結(jié)合在一起[23]。

圖3 凝血酶適體與凝血酶特異性結(jié)合形成復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)Fig.3 Spatial structure assumed for complex of thrombin with the thrombin aptamer

2 電化學(xué)適體傳感器

2.1 電化學(xué)適體傳感器簡(jiǎn)介

電化學(xué)傳感器是應(yīng)用最廣泛、最古老的傳感器類型之一。具有快響應(yīng)、高選擇性、高靈敏度、簡(jiǎn)單操作、低成本等顯著優(yōu)點(diǎn)。將適體作為識(shí)別元件與電化學(xué)生物傳感器結(jié)合在一起所構(gòu)建的電化學(xué)適體傳感器，集成了適體和電化學(xué)傳感器兩方面的優(yōu)勢(shì)，既具有電化學(xué)傳感器的高靈敏度、快響應(yīng)、簡(jiǎn)單操作、低成本，又具有適體的高選擇性和特異性，在環(huán)境污染物檢測(cè)、藥物篩選、疾病檢測(cè)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

電 化 學(xué) 適 體 傳 感 器 （electrochemical aptasensor）是以適體作為分子識(shí)別的接受器（receptor）并通過固定化技術(shù)將其結(jié)合到感受器表面。發(fā)生特異識(shí)別反應(yīng)后，生成適體-目標(biāo)分析物復(fù)合物與產(chǎn)生的信號(hào)相關(guān)聯(lián)，再以電化學(xué)電極、場(chǎng)效應(yīng)晶體管、熱敏電阻、壓電石英晶體等作為換能器（transducer）將其轉(zhuǎn)化為與目標(biāo)分析物濃度（或活度）有關(guān)的可定量或者可處理的電化學(xué)信號(hào)，這樣就可以根據(jù)電化學(xué)信號(hào)的改變實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的定量檢測(cè)。圖4是電化學(xué)適體傳感器的檢測(cè)原理示意圖。目前，用于固定適體的工作電極主要有玻碳電極[24]、絲網(wǎng)印刷碳電極[25]、金電極[26]、金陣列電極[27]、金芯片電極[28]和銦錫氧化物（ITO）電極[29]等。

圖4 電化學(xué)適體傳感器原理示意圖Fig.4 Scheme of the principle for an electrochemical aptasensor

2.2 電化學(xué)適體傳感器分類

2.2.1 以電化學(xué)適體傳感器的構(gòu)建原理分類

根據(jù)電化學(xué)適體傳感器的構(gòu)建原理將其分為單鏈核酸構(gòu)建的電化學(xué)適體傳感器、雙螺旋結(jié)構(gòu)的核酸構(gòu)建的電化學(xué)適體傳感器和兩條單鏈核酸構(gòu)建的電化學(xué)適體傳感器：

單鏈核酸構(gòu)建的電化學(xué)適體傳感器是指在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)條件下（如適當(dāng)?shù)臏囟?、pH值、離子強(qiáng)度等）將適體單鏈通過固定化技術(shù)固定到電極表面，然后將適體與目標(biāo)分析物直接特異結(jié)合，這一結(jié)合過程將引起電極表面電子傳遞效率的變化，從而進(jìn)一步引起電化學(xué)信號(hào)的改變。通過檢測(cè)電極表面電化學(xué)信號(hào)的變化就可以達(dá)到識(shí)別和高靈敏檢測(cè)目標(biāo)分析物的目的。如Degefa等[30]設(shè)計(jì)了將血小板生長(zhǎng)因子適體直接修飾在電極表面，適體與電惰性的血小板生長(zhǎng)因子特異結(jié)合后，電極表面空間位阻增大，根據(jù)電流信號(hào)的減小就可以完成對(duì)目標(biāo)分析物的定量檢測(cè)（圖5）。但是，在此類方法中，適體被固定在電極表面，由于適體片段較小，易影響其結(jié)構(gòu)，從而影響與目標(biāo)分析物的結(jié)合，因而其固定方法是關(guān)鍵點(diǎn)和難點(diǎn)。

圖5 單鏈核酸物質(zhì)體系構(gòu)建的電化學(xué)適體傳感器原理示意圖Fig.5 Scheme of the principle for a single-stranded based electrochemical aptasensor

雙螺旋結(jié)構(gòu)的核酸構(gòu)建的電化學(xué)適體傳感器是指將適體及其互補(bǔ)鏈形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)的雙鏈固載在電極表面，當(dāng)孵育目標(biāo)分析物溶液時(shí)，由于目標(biāo)分析物與適體的高親和力，原有的雙鏈解開，雙鏈中的適體探針或其互補(bǔ)鏈部分或完全脫離電極表面，這一過程將引起電極表面電子傳遞效率的變化，從而進(jìn)一步引起電化學(xué)信號(hào)的改變。通過檢測(cè)電極表面電化學(xué)信號(hào)的變化就可以達(dá)到識(shí)別和高靈敏檢測(cè)目標(biāo)分析物的目的。它根據(jù)dsDNA的雜交程度又可以分為不完全雙鏈結(jié)構(gòu)和完全雙鏈結(jié)構(gòu)。

如Xiao等[31]構(gòu)建了一種不完全雙螺旋結(jié)構(gòu)的凝血酶電化學(xué)適體傳感器。將凝血酶適體和標(biāo)記有電活性物質(zhì)亞甲藍(lán)MB的不完全雙螺旋結(jié)構(gòu)首先固載在電極表面。由于此時(shí)雙螺旋結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度較大，不利于MB與電極交換電子。當(dāng)孵育目標(biāo)分析物凝血酶后，原有雙螺旋結(jié)構(gòu)部分解開，MB接近電極表面，電化學(xué)信號(hào)增強(qiáng)（圖6）。

圖6 不完全雙螺旋結(jié)構(gòu)的凝血酶電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[31]Fig.6 Scheme of the principle for a double-stranded based thrombin electrochemical aptasensor[31]

Zuo等[32]制備了一種完全雙鏈結(jié)構(gòu)的腺苷電化學(xué)適體傳感器。首先將兩端分別修飾了巰基和電活性物質(zhì)二茂鐵的腺苷適體的互補(bǔ)鏈自組裝至金電極表面，然后雜交上腺苷適體。此時(shí)雙螺旋結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度超過電子最大隧穿距離（～10 nm），電活性物質(zhì)二茂鐵無法與電極交換電子，只能檢測(cè)到極微弱的電流信號(hào)。當(dāng)加入目標(biāo)分析物腺苷ATP后，ATP與適體結(jié)合，使原有的雙鏈完全解開，腺苷適體的互補(bǔ)鏈發(fā)生折疊，標(biāo)記的電活性物質(zhì)二茂鐵因此接近電極表面，電化學(xué)信號(hào)顯著增加，根據(jù)電化學(xué)信號(hào)的增加就可以完成對(duì)目標(biāo)分析物的定量檢測(cè)（圖7）。

圖7 完全雙螺旋結(jié)構(gòu)的腺苷電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[32]Fig.7 Scheme of the principle for a double-stranded based ATP electrochemical aptasensor[32]

兩條單鏈核酸物質(zhì)體系構(gòu)建的核酸適體電化學(xué)傳感器是基于構(gòu)建固相負(fù)載適體—目標(biāo)分析物—標(biāo)記適體夾心復(fù)合物的分析方法。其要求目標(biāo)分析物至少有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，才能先后與兩條適體結(jié)合，形成夾心之勢(shì)。即首先將能與目標(biāo)分析物特異性結(jié)合的一條適體作為捕獲探針通過固定化技術(shù)固定在電極上，待其與相應(yīng)的目標(biāo)分析物結(jié)合后，利用目標(biāo)分析物有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的特性，特異識(shí)別另一條標(biāo)記有酶、金屬離子、電活性物質(zhì)、納米材料等的檢測(cè)適體，形成適體—目標(biāo)分析物—標(biāo)記適體夾心復(fù)合物。這樣就可以通過標(biāo)記在檢測(cè)適體上的物質(zhì)來反應(yīng)出目標(biāo)分析物的濃度，靈敏度較高。這類傳感器也稱“夾心式”電化學(xué)適體傳感器。

Numnuam等[33]在金電極表面通過自組裝法首先組裝上一層凝血酶適體，然后與目標(biāo)分子凝血酶發(fā)生特異性識(shí)別，再與CdS標(biāo)記的適體結(jié)合，形成夾心結(jié)構(gòu)。然后用過氧化氫將Cd2+溶出，借助鎘離子選擇性電極來電化學(xué)檢測(cè)溶出的Cd2+電化學(xué)信號(hào)，從而完成對(duì)凝血酶的檢測(cè)，檢出限為0.14 nmol/L。Wang等[34]首先在納米金表面修飾大量的血小板生長(zhǎng)因子適體以得到功能化的納米金并以此作為第二適體。然后通過“夾心反應(yīng)”于金電極表面構(gòu)建適體/血小板生長(zhǎng)因子/功能化納米金顆粒三明治復(fù)合結(jié)構(gòu)（圖8）。因納米金顆粒表面適體帶負(fù)電，能通過靜電吸附作用吸附帶正電的電活性物質(zhì)[Ru(NH3)5Cl]2+。該傳感器電化學(xué)信號(hào)隨目標(biāo)分析物濃度增加而明顯增加，對(duì)目標(biāo)分析物血小板生長(zhǎng)因子的檢出限達(dá)0.01 pmol/L。此外，該適體傳感器具有很強(qiáng)的抗干擾能力，對(duì)血清和血漿中的凝血酶測(cè)定都得到令人滿意的結(jié)果，為傳感器有望應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)提供了可靠的依據(jù)。

圖8 “夾心式”電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[34]Fig.8 Scheme of the principle for the sandwich-type electrochemical aptasensor[34]

2.2.2 以適體是否被標(biāo)記分類

電化學(xué)適體傳感器根據(jù)適體是否被標(biāo)記可分為免標(biāo)記型和標(biāo)記型兩類：

免標(biāo)記型電化學(xué)適體傳感器對(duì)適體不需要進(jìn)行標(biāo)記，可以直接根據(jù)適體與目標(biāo)分析物識(shí)別前后所引起的電流、電阻等電化學(xué)信號(hào)的變化來進(jìn)行檢測(cè)的一類操作簡(jiǎn)單的傳感器。對(duì)于這類傳感器，電活性物質(zhì)一般有三種存在方式：一種存在于檢測(cè)溶液中；一種是通過靜電吸附作用直接吸附在適體表面；還有一種是直接修飾在電極表面。

Lee等[35]設(shè)計(jì)了一種基于凝血酶適體修飾熱解碳電極的免標(biāo)記型阻抗適體傳感器用于凝血酶的檢測(cè)。電活性物質(zhì)存在于檢測(cè)溶液中。由于凝血酶是生物大分子，阻礙電極表面電子傳遞，傳感器阻抗值隨著特異識(shí)別逐漸增加。Zayats等[36]制備了一種免標(biāo)記型腺苷適體電化學(xué)生物傳感器。利用化學(xué)鍵共價(jià)結(jié)合方法將腺苷適體及其互補(bǔ)鏈固定在電極表面，與目標(biāo)分析物結(jié)合后，適體互補(bǔ)鏈離開電極表面從而減少電極表面空間位阻。Peng等[37]在電極表面固定溶菌酶適體與其互補(bǔ)鏈，檢測(cè)底液中的Fe(CN)63-/4-離子作為氧化還原探針。由于適體不導(dǎo)電以及帶負(fù)電荷，此時(shí)雙鏈修飾的電極電阻較大。當(dāng)適體與溶菌酶結(jié)合后，溶菌酶適體離開電極表面，引起電極表面空間位阻和負(fù)電荷減小，電子轉(zhuǎn)移速率因此大大的增加，隨著溶菌酶濃度的逐漸增加，電極表面電子轉(zhuǎn)移電阻隨之相應(yīng)減少，檢出限達(dá)0.07 nmol/L（圖9）。這類傳感器構(gòu)建簡(jiǎn)單，但電活性物質(zhì)存在于溶液中，電極表面易受到污染。

后來研究者將電活性物質(zhì)直接修飾在電極表面，這樣有效克服以上缺點(diǎn)，同時(shí)一定程度上減少了電活性物質(zhì)與電極表面的距離，電化學(xué)信號(hào)增強(qiáng)。Shen等[38]將巰基修飾的腺苷適體與一條較短的互補(bǔ)鏈雜交并固定至金電極表面,帶負(fù)電的雙鏈可有效地將帶正電的六氨合釕陽離子吸附在電極表面。腺苷與適體結(jié)合后，雙鏈解開攜帶部分六氨合釕陽離子離開電極表面，電信號(hào)降低（圖10）。這類傳感器構(gòu)建簡(jiǎn)單，但是穩(wěn)定性較差。

圖9 電活性物質(zhì)在溶液中的免標(biāo)記型電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[37]Fig.9 Scheme of the principle for label-free electrochemical aptasensor with electroactive substances presence in solution[37]

圖10 通過靜電吸附作用結(jié)合電活性物質(zhì)與電極表面的免標(biāo)記型[38]電化學(xué)適體傳感器原理示意圖Fig.10 Scheme of the principle for label-free electrochemical aptasensor with electroactive substances modified on electrode surface via electrostatic interaction[38]

因此，Du等將聚乙烯亞胺與二茂鐵形成的復(fù)合物（Fc-PEI）通過層層自組裝直接修飾在電極表面形成含有大量電活性物質(zhì)的多層復(fù)合膜。然后將可卡因適體[39]或凝血酶適體[40]修飾在電極上，當(dāng)與目標(biāo)分析物可卡因或凝血酶特異結(jié)合后，由于可卡因和凝血酶阻礙電子傳遞，電極表面空間位阻增大，電流減小。該傳感器對(duì)可卡因和凝血酶的檢出限分別可達(dá)0.1 μmol/L和0.14 ng/mL（圖11）。這類傳感器無需標(biāo)記、成本低、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)單、假陽信號(hào)率低，而且不損傷適體的活性，然而有個(gè)缺點(diǎn)就是靈敏度相對(duì)較低。

圖11 電活性物質(zhì)修飾在電極表面的免標(biāo)記型電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[40]Fig.11 Scheme of the principle for the label-free electrochemical aptasensor with electroactive substances modified on electrode surface[40]

標(biāo)記型電化學(xué)適體傳感器是用納米粒子（量子點(diǎn)納米粒子、鉑納米粒子等）、電活性物質(zhì)（如亞甲藍(lán)、二茂鐵等）或酶 （如辣根過氧化物酶HRP，葡萄糖脫氫酶GOD等）對(duì)適體進(jìn)行標(biāo)記，然后根據(jù)適體與目標(biāo)分析物特異識(shí)別前后標(biāo)記物所產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)的改變來完成目標(biāo)分析物的定量檢測(cè)的一類傳感器。

Lai等[41]將末端修飾亞甲基藍(lán)MB的血小板生長(zhǎng)因子適體固定在金電極上。利用目標(biāo)分析物血小板生長(zhǎng)因子與適體結(jié)合前后MB距離電極的遠(yuǎn)近實(shí)現(xiàn)對(duì)血小板生長(zhǎng)因子的定量檢測(cè) （圖12）。同樣原理也適用于Xiao等[42]構(gòu)建的凝血酶適體傳感器，檢出限達(dá)6.4 nmol/L。Hu等[43]設(shè)計(jì)了一條能部分形成雙鏈的適體，當(dāng)有目標(biāo)分析物組氨酸存在下，組氨酸將適體剪切成兩段，而剪切下來的一條適體正好能同時(shí)與溶液中標(biāo)記有二茂鐵的適體和修飾在金電極上的DNA部分雜交形成“Y”結(jié)構(gòu)。通過測(cè)定電流信號(hào)的增加就可以測(cè)出目標(biāo)分析物組氨酸的濃度。標(biāo)記型電化學(xué)傳感器靈敏度高，但識(shí)別物需要標(biāo)記、操作步驟多、較繁瑣、成本高。

圖12 標(biāo)記型血小板生長(zhǎng)因子電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[41]Fig.12 Scheme of the principle for the MB-labeled electrochemical aptasensor[41]

2.2.3 以適體與目標(biāo)分析物結(jié)合前后信號(hào)的變化分類

電化學(xué)適體傳感器根據(jù)適體探針與目標(biāo)分析物特異識(shí)別前后電化學(xué)信號(hào)的改變可分為信號(hào)衰減（signal-off）型和信號(hào)增強(qiáng)（signal-on）型兩類：

signal-off型電化學(xué)適體傳感器是以目標(biāo)分析物與適體結(jié)合后所導(dǎo)致的電化學(xué)信號(hào)衰減程度為定量分析信號(hào)。Liu等[9]制備了電化學(xué)信號(hào)signal-off型適體傳感器用于干擾素IFN-γ的高靈敏測(cè)定。首先將干擾素適體末端修飾電活性物質(zhì)亞甲藍(lán)MB并將其通過固定化技術(shù)修飾在電極上形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，此時(shí)MB與電極之間的距離較近，電子傳遞速率快，電流信號(hào)大。然而，當(dāng)適體與目標(biāo)分析物IFN-γ特異識(shí)別后，迫使發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，同時(shí)MB遠(yuǎn)離電極表面，得到明顯降低的電化學(xué)信號(hào)。該傳感器操作簡(jiǎn)便且靈敏度高，對(duì)目標(biāo)分析物IFN-γ的檢出限可達(dá)到0.06 nmol/L。Xu等[44]設(shè)計(jì)了基于不規(guī)則納米金修飾電極的signal-off型電化學(xué)適體傳感器用于凝血酶的檢測(cè)。首先將凝血酶適體修飾在不規(guī)則納米金表面，在檢測(cè)底液中存在電活性物質(zhì)二茂鐵的情況下表現(xiàn)出較高的氧化峰電流。當(dāng)適體探針與目標(biāo)分析物凝血酶特異識(shí)別后，由于蛋白質(zhì)是惰性生物大分子，電極表面的空間位阻將增大，氧化峰電流因此相應(yīng)減小，從而成功制備了signal-off型電化學(xué)適體傳感器（圖13）。該傳感器提供了一種通用的電化學(xué)檢測(cè)方法，可以廣泛應(yīng)用于其他物質(zhì)的檢測(cè)。實(shí)現(xiàn)了快速、靈敏檢測(cè)目標(biāo)分析物。同樣原理也適用于McMullan等[45]構(gòu)建的signaloff型電化學(xué)適體傳感器。與之不同的是該傳感器的電活性物質(zhì)氨基釕是通過靜電吸附作用直接修飾在凝血酶適體表面。

圖13 基于不規(guī)則納米金修飾電極的signal-off型電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[44]Fig.13 Scheme of the principle for the fractal gold-based signal-off electrochemical aptasensor[44]

此外，F(xiàn)eng等[46]構(gòu)建了基于雙螺旋結(jié)構(gòu)的signal-off型電化學(xué)適體傳感器。腺苷適體及其互補(bǔ)鏈被直接修飾在電極表面，電活性物質(zhì)亞甲藍(lán)MB鑲嵌在雙鏈中間，通過腺苷適體與目標(biāo)分析物腺苷結(jié)合后脫離電極表面帶走一部分MB實(shí)現(xiàn)對(duì)腺苷定量檢測(cè)。Signal-off型電化學(xué)傳感器雖然可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的定量檢測(cè)，但這類傳感器是根據(jù)適體探針與目標(biāo)分析物特異結(jié)合后所導(dǎo)致的信號(hào)降低來完成目標(biāo)分析物的定量檢測(cè)，該方法本身有一定的局限性，背景信號(hào)較大，檢出限高，限制了傳感器的靈敏度。并且，污染物以及其它物質(zhì)所產(chǎn)生的“假信號(hào)”與特異目標(biāo)分析物的結(jié)合所產(chǎn)生的信號(hào)很難區(qū)別。

Signal-on型電化學(xué)適體傳感器是以目標(biāo)分析物與適體結(jié)合后所導(dǎo)致的電化學(xué)信號(hào)增強(qiáng)程度為定量分析信號(hào)。該方法的出現(xiàn)有效克服了上述signal-off型適體傳感器的缺點(diǎn)。成功實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確、快速、高靈敏檢測(cè)目標(biāo)分析物。Radi等[47]設(shè)計(jì)了一種signal-on型電化學(xué)傳感器用于直接檢測(cè)凝血酶。首先將末端修飾有二茂鐵的凝血酶適體捕獲探針通過自組裝技術(shù)修飾在金電極表面。此時(shí)，由于凝血酶適體處于半折疊狀態(tài)，電流信號(hào)較小，當(dāng)凝血酶適體與目標(biāo)分析物凝血酶特異識(shí)別后，二茂鐵與電極表面之間的距離相應(yīng)縮短，電子傳輸效率提高，電流信號(hào)隨之相應(yīng)變大。該Signal-on型傳感器在實(shí)際樣品中顯示出優(yōu)越的穩(wěn)定性，對(duì)凝血酶的檢出限達(dá)到0.5 nmol/L。Zhang等[48]提出了表面臨近雜交型signal-on電化學(xué)適體傳感器。一對(duì)相同的尾端標(biāo)記有二茂鐵的適體同時(shí)識(shí)別以二聚體形式存在的血小板生長(zhǎng)因子PDGF-BB后，由于臨近效應(yīng)使適體探針兩尾端序列同時(shí)與電極表面固定的兩條短鏈DNA雜交，促使二茂鐵充分靠近電極表面，產(chǎn)生顯著的氧化還原電流。該傳感器響應(yīng)范圍可從1.0 pg/L到20 ng/L，檢出限可達(dá)1.0 pg/L。Zuo等[49]報(bào)道了一種基于夾心法的signal-on型電化學(xué)傳感器，如圖14所示，小分子目標(biāo)分析物的適體鏈被巧妙的設(shè)計(jì)成兩段，其中一段通過自組裝技術(shù)修飾在金電極表面，另一段末端標(biāo)記上電活性物質(zhì)MB。當(dāng)目標(biāo)物存在并與兩段核酸適體結(jié)合形成三明治結(jié)構(gòu)時(shí)，MB與電極的距離變近，電流信號(hào)增強(qiáng)。該方法成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)實(shí)際樣品血液中可卡因及ATP小分子的高靈敏檢測(cè)。

圖14 基于目標(biāo)物適體分兩段構(gòu)建signal-on型電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[49]Fig.14 Scheme of the principle for the signal-on electrochemical aptasensor with target probe divided into two parts[49]

2.3 適體的固定化方法

適體的固定化是電化學(xué)適體傳感器構(gòu)建的首要問題。適體的固定量、定向以及活性直接影響著電化學(xué)適體傳感器的靈敏度和選擇性。為了把適體牢固修飾在電極表面，常常需要借助有效的物理或化學(xué)方法。傳統(tǒng)比較常見的吸附法和包埋法是最簡(jiǎn)單的固定化方法，但構(gòu)建的傳感器存在定向性差的缺點(diǎn)，不利于適體與目標(biāo)分析物的結(jié)合。目前報(bào)道的適體固定化方法主要有自組裝膜法、共價(jià)鍵合法、親和素-生物素法和互補(bǔ)核苷酸鏈連接法。

2.3.1 自組裝膜法

在電化學(xué)適體傳感器中，自組裝膜法是在金電極表面進(jìn)行適體固定最常用的方法之一。該方法一般以金電極作為基體電極，然后對(duì)適體末端（3′或5′）標(biāo)記巰基基團(tuán)，在金硫鍵成鍵驅(qū)動(dòng)作用力下將適體有序吸附在傳感器金載體表面并形成單層膜。該方法的結(jié)合力強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，得到的修飾表面適體探針高度有序且穩(wěn)定性好，對(duì)目標(biāo)分析物表現(xiàn)出很高的特異性和選擇性。但是，該自組裝膜法要求巰基修飾的適體純度較高，而分離提純操作繁瑣。另外還有不足之處就是金除了跟巰基結(jié)合外，同樣能和適體的堿基發(fā)生非特異性結(jié)合，使適體平躺于電極表面。因而一般需要再組裝第二層疏基層，常用的是巰基小分子，如疏基己醇，它不僅可有效減少適體中堿基與金之間的相互作用，占據(jù)金電極表面上未被適體占據(jù)的位點(diǎn)，而且它帶負(fù)電的羥基基團(tuán)能與同樣帶負(fù)電的適體產(chǎn)生排斥作用，從而促使適體鏈以一定角度直立在電極表面，形成結(jié)構(gòu)較為緊密的適體修飾層，有效地提高了親合反應(yīng)效率，大大降低了傳感器假陽性信號(hào)[50~51]。如Xu等[52]成功將帶巰基的凝血酶適體自組裝在金電極表面構(gòu)建了一種免標(biāo)記的阻抗性電化學(xué)適體傳感器。該傳感器操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、靈敏度較高，對(duì)凝血酶的檢測(cè)達(dá)到0.01 pmol/L。

2.3.2 共價(jià)鍵合法

共價(jià)鍵合法是以形成共價(jià)鍵（如酯鍵、醚鍵、酰胺鍵等）的方式使適體探針固定在電極表面的一種常用方法。此方法一般是首先對(duì)電極進(jìn)行預(yù)處理以引入氨基、羧基、羥基等活性基團(tuán)，或?qū)塑账徇M(jìn)行衍生，使其帶上合適的功能團(tuán)，隨后用雙官能團(tuán)試劑（戊二醛、對(duì)硝基苯氯甲酸醋等）或偶聯(lián)活化劑（馬來酞亞胺、二異硫氰酸醋等）通過共價(jià)鍵合反應(yīng)把適體固定在電極表面。共價(jià)鍵合法在適體傳感器中的應(yīng)用有效提高了適體傳感器表面固定適體的特異性,減少了非特異性吸附所產(chǎn)生的干擾信號(hào)。此外，該方法一定程度提高了適體的牢固度及耐用性。共價(jià)鍵合法在制備電化學(xué)適體傳感器中應(yīng)用廣泛，是諸多固定探針方法中較為理想的方法。但該固定方法需要對(duì)電極表面引入合適的功能團(tuán),步驟比較繁瑣,同時(shí)也會(huì)帶入許多新的干擾因素,如表面活化劑、交聯(lián)劑等的副作用。另一方面，電極表面有限的活性位點(diǎn)以及異相結(jié)合反應(yīng)使得適體的固定量有限，一定程度影響了電化學(xué)生物傳感器的靈敏度。因此,需要綜合考慮反應(yīng)體系中各種化學(xué)試劑、適體、目標(biāo)分析物最佳反應(yīng)所需的理化條件、濃度等。

2.3.3 生物素—親和素法

生物素（Biotin）是從動(dòng)、植物組織中提取的輔酶。它具有兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)：其中Ⅰ環(huán)是能與親和素特異結(jié)合的咪哇酮環(huán)；Ⅱ環(huán)為唆吩環(huán)，有一戊酸側(cè)鏈，其末端羧基是與適體結(jié)合的唯一結(jié)構(gòu)。生物素標(biāo)記適體后既不影響其與親和素的結(jié)合，也不影響適體的活性。親和素（Avidin）是從卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，由4個(gè)含有相同結(jié)合位點(diǎn)的亞基組成，能與4個(gè)生物素結(jié)合形成高度穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，親和常數(shù)為1015mol/L，幾乎與共價(jià)鍵相當(dāng)。早在1986年，Ross等[53]就報(bào)道了這種親和作用不容易受到溫度、pH和有機(jī)溶劑的影響。因此，親和素（及其衍生物）和生物素之間的高特異性和親合力被廣泛用于適體在傳感器表面的固定。Kawde等[54]利用生物素—親和素固定化法構(gòu)建了溶菌酶電化學(xué)適體傳感器。首先將親和素修飾在磁性納米粒子表面，然后加入標(biāo)記有生物素的適體探針，利用生物素—親和素之間的相互作用將適體固定到磁性納米粒子表面，當(dāng)加入目標(biāo)分析物溶菌酶后，磁性微珠表面形成了適體—溶菌酶復(fù)合物。使用氫氧化鈉分解復(fù)合物釋放出捕獲的溶菌酶，最后利用電位溶出技術(shù)檢測(cè)溶菌酶，檢出限為7 nmol/L。Liao等[55]利用堿性磷酸酯酶標(biāo)記親和素構(gòu)建了原位產(chǎn)生共反應(yīng)試劑的電致化學(xué)發(fā)光凝血酶適體傳感器。發(fā)光物質(zhì)聯(lián)吡啶釕和鉑納米粒子首先通過靜電吸附作用固定在Nafion電極表面，然后將堿性磷酸酯酶標(biāo)記的親和素固定在鉑納米粒子表面，通過生物素—親和素之間的相互作用將凝血酶適體探針固定在電極表面以直接檢測(cè)凝血酶。實(shí)驗(yàn)表明，該傳感器對(duì)凝血酶的檢出限為0.33 fmol/L。生物素標(biāo)記的適體與親和素相互作用所構(gòu)建的適體傳感器可以用來檢測(cè)多種目標(biāo)物質(zhì),如抗生素、蛋白質(zhì)、生物毒素等。此外，由于1個(gè)親和素分子可以結(jié)合4個(gè)生物素標(biāo)記的適體,相比于其它固定方式,該方法可以有效增加傳感器表面適體的固定量，減少非特異性吸附的發(fā)生,提高傳感器的信噪比。因此,該方法所構(gòu)建的電化學(xué)適體傳感器可以廣泛的應(yīng)用于藥物分析、疾病診斷及食品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。

2.3.4 互補(bǔ)核苷酸鏈連接法

互補(bǔ)核苷酸鏈連接法是指通過適體末端連接的一小段核苷酸短鏈或適體直接與傳感器表面修飾的另一段相應(yīng)互補(bǔ)短鏈雜交而被固定的方法。Zhang等[56]設(shè)計(jì)了一種基于互補(bǔ)核苷酸鏈連接法修飾適體的超靈敏電化學(xué)適體傳感器（圖15）。能與腺苷適體部分互補(bǔ)的一小段核苷酸短鏈?zhǔn)紫缺还潭ㄔ陔姵练e的納米金表面，然后將腺苷適體通過末端互補(bǔ)短鏈連接的方式固定在電極表面。由于腺苷適體部分與短鏈互補(bǔ)，還能剩余一部分堿基與納米金標(biāo)記的核苷酸短鏈互補(bǔ)結(jié)合。此時(shí)電極表面帶有較多的負(fù)電荷，能將電活性物質(zhì)氨基釕通過靜電吸附作用修飾在電極表面。當(dāng)反應(yīng)體系中加入目標(biāo)分析物腺苷時(shí)，適體就會(huì)與腺苷結(jié)合，從而使納米金標(biāo)記的核苷酸短鏈解離下來并帶走部分氨基釕。Wang等[57]設(shè)計(jì)了相類似的傳感器，同樣也是將能與腺苷適體部分互補(bǔ)的一小段核苷酸短鏈?zhǔn)紫裙潭ㄔ诮痣姌O表面,然后將腺苷適體通過末端互補(bǔ)短鏈連接的方式固定在電極表面并通過靜電吸附作用吸附帶正電的電活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)MB，通過適體與腺苷結(jié)合后解離電極表面帶走部分MB完成腺苷的定量檢測(cè)。從上面可以看出，互補(bǔ)核苷酸鏈連接法在電化學(xué)適體傳感器中的應(yīng)用一般是基于目標(biāo)分析物的加入會(huì)引起互補(bǔ)核苷酸鏈或適體解離,從而導(dǎo)致電化學(xué)信號(hào)的變化。該類傳感器在檢測(cè)過程中電化學(xué)信號(hào)的產(chǎn)生不依賴于適體構(gòu)象的變化或是目標(biāo)分析物多結(jié)合位點(diǎn)的要求，對(duì)各種電化學(xué)適體傳感器都適用。然而，由于適體的固定涉及到核苷酸鏈的退火雜交，實(shí)驗(yàn)條件難以控制。同時(shí)適體與傳感器表面互補(bǔ)短鏈連接時(shí)，二者帶有相同電性的負(fù)電荷，靜電排斥力和空間位阻較大。因此，需要通過改變體系的理化性質(zhì)，優(yōu)化適體在傳感器表面的固定過程來解決上述問題。

圖15 基于互補(bǔ)核苷酸鏈連接法修飾適體的超靈敏電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[56]Fig.15 Scheme of the principle for the ultrasensitive electrochemical aptasensor with complementary chain as linker[56]

2.4 電化學(xué)分析技術(shù)

電化學(xué)分析方法是利用被測(cè)物含量變化引起電流、阻抗、電位、電導(dǎo)或電量等電學(xué)參量發(fā)生相應(yīng)變化來完成被測(cè)物定量分析的一種分析方法。該方法不僅能對(duì)傳感器組成和形態(tài)進(jìn)行分析，而且對(duì)其修飾過程的理論研究具有十分重要的意義。對(duì)于電化學(xué)適體傳感器來說，電化學(xué)適體傳感器的電化學(xué)定量檢測(cè)方法可根據(jù)不同電學(xué)參量分為電化學(xué)阻抗法、循環(huán)伏安法、差分脈沖伏安法、溶出伏安法、交流伏安法和方波伏安法等。下面主要對(duì)電化學(xué)阻抗法、循環(huán)伏安法、差分脈沖伏安法和溶出伏安法進(jìn)行簡(jiǎn)要地介紹。

2.4.1 電化學(xué)阻抗法

電化學(xué)阻抗譜 （electrochemical impedance spectroscopy,EIS）又稱電化學(xué)阻抗法，是近年來發(fā)展迅速的一種電化學(xué)分析方法，具有良好的界面表征作用，是研究生物分子間相互作用的重要技術(shù)[58]，特別適合于分析傳感器表面生物敏感膜的制備和生物學(xué)反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)機(jī)制,已逐漸成為生物傳感器研究的有效輔助方法。電化學(xué)阻抗法是以Fe(CN)63-/4-等作為氧化還原探針，由于電極上不存在阻擋電子傳輸?shù)奈镔|(zhì)，裸電極的阻抗圖譜在所有頻率范圍內(nèi)基本是一條直線，氧化還原反應(yīng)受擴(kuò)散控制。當(dāng)適體探針修飾在電極表面后，由于適體探針帶負(fù)電荷，將通過靜電排斥作用阻礙Fe(CN)63-/4-向電極表面的擴(kuò)散，電子傳遞阻抗值較裸電極的大，當(dāng)適體探針與目標(biāo)分析物蛋白質(zhì)結(jié)合后，由于蛋白質(zhì)的電惰性，電子傳遞阻抗值變大，相應(yīng)的在阻抗譜圖上表現(xiàn)為高頻部分半圓逐漸變大。這樣就可以根據(jù)適體探針與蛋白質(zhì)特異識(shí)別前后電阻的變化值來完成對(duì)蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)。

2005年，Radi等[26]首次將EIS引入到電化學(xué)適體傳感器中，具體操作如下：凝血酶適體首先被固定在金電極表面，以溶液中的Fe(CN)63-/4-離子作為氧化還原探針。由于凝血酶生物大分子的特性，適體與凝血酶結(jié)合后會(huì)引起電子轉(zhuǎn)移電阻的增加，界面電子轉(zhuǎn)移電阻隨著凝血酶濃度的提高而相應(yīng)增加，檢測(cè)下限達(dá)2.0 nmol/L。該傳感器操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，傳感器的再生是通過在2.0 nmol/L的NaCl溶液中浸泡10 min得到的，重復(fù)使用15次阻抗值沒有明顯的變化。為了進(jìn)一步提高電極的靈敏度，Deng等[59]構(gòu)建了基于納米金放大的夾心式EIS電化學(xué)適體傳感器 （圖16）。帶巰基的凝血酶適體首先固定在金電極表面，通過夾心反應(yīng)將凝血酶和標(biāo)記有金納米粒子的第二適體結(jié)合在電極表面。由于適體帶負(fù)電荷，凝血酶是生物大分子，凝血酶和標(biāo)記有金納米粒子的第二適體結(jié)合在電極表面后電阻依次增大。進(jìn)一步靈敏度的提高采用了NADH于金納米粒子表面原位還原氯金酸以得到粒徑增大的金納米粒子，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該傳感器具有較高的靈敏度，對(duì)凝血酶的檢出限可達(dá)到100 fmol/L。

圖16 基于金納米粒子放大的阻抗型電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[59]Fig.16 Scheme of the principle for the EIS electrochemical aptasensor[59]

2.4.2 循環(huán)伏安法

循環(huán)伏安法（Cyclic Voltammetry,CV）是一種常用的電化學(xué)研究方法，可用于判斷電極反應(yīng)的可逆程度，電極吸附現(xiàn)象，電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物，電化學(xué)—化學(xué)耦聯(lián)反應(yīng)等,對(duì)于有機(jī)物、金屬有機(jī)化合物及生物物質(zhì)的氧化還原機(jī)理研究很有用。常用來測(cè)量電極反應(yīng)參數(shù)，判斷其控制步驟和反應(yīng)機(jī)理，并觀察整個(gè)電勢(shì)掃描范圍內(nèi)可發(fā)生哪些反應(yīng)及其性質(zhì)如何。對(duì)于一個(gè)新的電化學(xué)體系，首選的研究方法往往就是循環(huán)伏安法，可稱之為“電化學(xué)的譜圖”。Kuang等[60]構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單、快速的signal-off型電化學(xué)適體傳感器并采用循環(huán)伏安法檢測(cè)目標(biāo)分析物赭曲霉素（圖17）。三段單鏈DNA，包括赭曲霉素適體和納米金標(biāo)記的單鏈NDA被固定在金電極表面，由于納米金具有良好的導(dǎo)電性，此時(shí)傳感器在電活性物質(zhì)亞甲藍(lán)存在下呈現(xiàn)出較高的循環(huán)伏安峰電流。而標(biāo)記有納米金的適體與目標(biāo)分析物結(jié)合后離開電極表面帶有部分導(dǎo)電的納米金，循環(huán)伏安峰電流減小。隨著赭曲霉素濃度的增大，電流值逐漸減小，實(shí)驗(yàn)表明對(duì)赭曲霉素的檢測(cè)達(dá)到30 pg/mL。

圖17 基于循環(huán)伏安法檢測(cè)赭曲霉素的電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[60]Fig.17 Scheme of the principle for the electrochemical aptasensor[60]

2.4.3 溶出伏安法

溶出伏安法（Stripping Voltammetry,SV）是電解溶出過程和電解沉積過程相結(jié)合的一種電化學(xué)檢測(cè)方法，是由極譜法發(fā)展優(yōu)化得來的。在該方法中，被測(cè)離子在一定電位下首先被電解沉積，然后在反向電位轉(zhuǎn)換的作用下，已經(jīng)沉積在電極表面的離子將發(fā)生電解溶出，這個(gè)溶出過程的所記錄的伏安曲線就稱為溶出伏安曲線。在進(jìn)行測(cè)定時(shí)，被測(cè)離子的性質(zhì)決定了溶出伏安曲線出峰的電位。峰電流的大小直接與被測(cè)離子濃度成正比。由于被測(cè)離子在電極表面的沉積相當(dāng)于濃縮富集，濃度大大的提高了，因此在溶出過程中電流較大，靈敏度較高。然而，由于被測(cè)物質(zhì)富集量的多少與電解富集電位、電極面積、時(shí)間和攪拌速率有一定關(guān)系，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，而且應(yīng)使電解溶出過程中溶液保持靜止。

2.4.4 差分脈沖伏安法

差 分 脈 沖 伏 安 法 （differential pulse voltammetry,DPV）是指電壓在緩慢線性變化的情況下對(duì)恒定振幅的矩形脈沖電位進(jìn)行疊加。差分脈沖伏安法實(shí)際是對(duì)疊加脈沖前的某一時(shí)間和脈沖終止前的某一時(shí)間電流進(jìn)行的測(cè)量，記錄的是兩次電流差，因而得到的差分脈沖伏安曲線能有效地消除背景電流的影響，比循環(huán)伏安法具有更高的檢測(cè)靈敏度和更低的檢出限。Du等[61]構(gòu)建了免標(biāo)記型電化學(xué)適體傳感器并用差分脈沖伏安法分別完成對(duì)凝血酶和溶血酶的定量檢測(cè)，檢出限分別為0.14 ng/mL和0.17 ng/mL。Ding等[62]設(shè)計(jì)了一種新型的夾心式凝血酶電化學(xué)適體傳感器并同樣采用差分脈沖伏安法對(duì)其檢測(cè)凝血酶的性能進(jìn)行了測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)凝血酶的檢測(cè)可達(dá)0.55 fmoL/L，具有較低的檢出限。差分脈沖伏安法屬于全定量分析，與半定量分析的循環(huán)伏安法相比，其準(zhǔn)確度大大提高了。

3 信號(hào)放大技術(shù)在電化學(xué)適體傳感器中的應(yīng)用

在電化學(xué)適體傳感器中，一個(gè)指示探針對(duì)應(yīng)的電活性指示劑只能產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)電子，因此檢測(cè)的靈敏度較低。為了提高檢測(cè)靈敏度，需要運(yùn)用到信號(hào)放大技術(shù)，它是實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量蛋白等定量測(cè)定的常用手段之一[63]。以下就不同信號(hào)放大技術(shù)的電化學(xué)適體傳感器在無機(jī)離子、有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)定量檢測(cè)分別作簡(jiǎn)要介紹。

3.1 納米粒子信號(hào)放大技術(shù)在電化學(xué)適體傳感器中的應(yīng)用

納米粒子是指基本單元的顆?；蚓Я３叽缭?~100 nm之間的材料。納米粒子結(jié)構(gòu)既不同于體塊材料，也不同于單個(gè)的原子，具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)（如小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)等）。納米粒子所具有的小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)使其與其它原子結(jié)合時(shí)表現(xiàn)出很高的化學(xué)活性，易與其他原子結(jié)合而使納米粒子的比表面積、表面能及表面結(jié)合能迅速增大。因此，利用納米粒子這些特點(diǎn)可將其作為固載基質(zhì)固載標(biāo)記物（如酶、信號(hào)物質(zhì)等），有效高標(biāo)記物的固載量。此外，納米粒子具有良好的生物相容性，能提供一個(gè)類似生物分子本體環(huán)境的微環(huán)境，起到保持生物組分活性的良好作用。以上這些獨(dú)特的性能使納米粒子能夠充分滿足傳感器多功能、微型化、高速化的要求。因此納米粒子非常適合用于構(gòu)制高選擇性、高靈敏度的電化學(xué)適體傳感器。目前碳納米管、石墨烯、納米金和磁珠作為信號(hào)放大在這方面的應(yīng)用最為常見。

Fu等[64]同時(shí)結(jié)合納米磁珠和碳納米管信號(hào)放大構(gòu)建了夾心式電化學(xué)適體傳感器。構(gòu)建如圖18所示，納米磁珠首先用于固載大量凝血酶適體，與此同時(shí)制備了碳納米管包裹凝血酶適體的復(fù)合物。在溶液中存在目標(biāo)分析物凝血酶時(shí)，納米磁珠包裹的凝血酶適體和碳納米管包裹凝血酶適體將凝血酶通過夾心反應(yīng)結(jié)合在兩者之間，然后利用納米磁珠的磁性將所形成的納米磁珠包裹的凝血酶適體—凝血酶—碳納米管包裹凝血酶適體復(fù)合物聚集在金電極表面。由于適體帶負(fù)電，能將帶正電荷的電活性物質(zhì)亞甲藍(lán)MB吸附在電極表面，這樣就可以通過檢測(cè)MB的電信號(hào)完成對(duì)凝血酶的高靈敏檢測(cè)。該傳感器的高靈敏度主要?dú)w結(jié)于以下兩點(diǎn)：首先由于納米磁珠具有大的比表面積，能固載多的凝血酶適體，一定程度提高了凝血酶的結(jié)合量。同時(shí)，碳納米管良好的導(dǎo)電性大大改善了形成的夾心復(fù)合物對(duì)電極表面電子傳遞的阻礙作用。此外，Xiang等[65]利用具有良好導(dǎo)電性和大比表面積的碳納米管固載大量堿性磷酸酯酶和凝血酶適體以形成第二適體，通過夾心反應(yīng)后將其結(jié)合在電極表面。在雙酶放大體系作用下，該傳感器對(duì)凝血酶的檢出限達(dá)到8.3 fmol/L。Li等[66]用金納米粒子增加凝血酶適體互補(bǔ)鏈固載量構(gòu)建了signal off型電致化學(xué)發(fā)光傳感器以及用納米管固載發(fā)光試劑釕和凝血酶適體構(gòu)建了夾心式傳感器，對(duì)凝血酶的檢測(cè)分別為0.8 pmol/L和3 fmol/L。

圖18 基于納米磁珠和碳納米管放大的電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[64]Fig.18 Scheme of the principle for the electrochemical aptasensor with magnatic bead and carbon nanotubes for amplification[64]

3.2 酶催化信號(hào)放大技術(shù)在電化學(xué)適體傳感器中的應(yīng)用

酶（enzyme）是一類由生物體產(chǎn)生的具有生命調(diào)節(jié)能力的蛋白質(zhì)，人體中各種代謝反應(yīng)都離不開酶的參與，在生命過程中扮演著重要的角色，具有高效的催化能力和高度的專一性，因此，將酶催化運(yùn)用到高靈敏度傳感器的構(gòu)建具有非常重要的意義。酶催化信號(hào)放大有效改善電化學(xué)傳感器靈敏度是通過酶催化底物氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生電子循環(huán)而實(shí)現(xiàn)的。一般情況下，酶在電極表面的固定是通過共價(jià)鍵合和納米技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，因此酶催化信號(hào)放大往往與納米放大技術(shù)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)信號(hào)雙重放大。

Zhao等[67]制備了一種新型的殼聚糖—金納米復(fù)合粒子并用于固載大量辣根過氧化物酶HRP和凝血酶適體。與此同時(shí)制備了納米金包裹的磁珠復(fù)合物固載另一段凝血酶適體，在溶液中存在目標(biāo)分析物凝血酶時(shí)，兩條凝血酶適體通過夾心反應(yīng)結(jié)合在一起，然后利用納米磁珠的磁性將所形成的夾心復(fù)合物富集在電極表面。此時(shí)電極表面的辣根過氧化物酶能對(duì)檢測(cè)溶液中電活性物質(zhì)對(duì)苯二酚的氧化還原反應(yīng)起到催化作用，顯著提高了傳感器的靈敏度（圖19）。Centi等[68]利用夾心反應(yīng)將標(biāo)記有生物素的凝血酶適體修飾在電極表面，利用親和素—生物素之間的特異性結(jié)合將堿性磷酸酶修飾在電極表面，而此時(shí)堿性磷酸酶就能有效地催化底物水解產(chǎn)生氧化還原物質(zhì)完成對(duì)凝血酶蛋白檢測(cè)。Bai等[69]以Pt納米粒子修飾的石墨烯固載葡萄糖氧化酶并將此復(fù)合物標(biāo)記適體制備了第二適體偶合物，采用夾心模式形成適體—凝血酶—適體復(fù)合物。此時(shí)，結(jié)合在電極表面的葡萄糖脫氫酶能催化底物葡萄糖產(chǎn)生過氧化氫，而產(chǎn)生的過氧化氫又被Pt納米催化還原，形成了催化葡萄糖脫氫酶自身氧化還原反應(yīng)的雙酶放大體系。

圖19 基于殼聚糖-金和辣根過氧化物酶雙重信號(hào)放大的電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[67]Fig.19 Dual amplification strategy of highly sensitive thrombin amperometric aptasensor based on chitosan-Au nanocomposites and HRP[67]

在酶催化信號(hào)放大技術(shù)中，常用的酶有葡萄糖脫氫酶、堿性磷酸酯酶、辣根過氧化物酶等，這些都是蛋白質(zhì)，其催化活性易受溫度、酸度等環(huán)境因素的影響，而且成本也高。1998年，Travascio等[70]首次提出了一種具有G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA酶（圖20）。這種G-四鏈體DNA酶是由一段富含G堿基的寡核酸序列與卟啉鐵（hemin）配位結(jié)合構(gòu)成的具有很強(qiáng)結(jié)合能力的配合物，又稱辣根過氧化物模擬酶 （G-四鏈體-卟啉鐵,hemin/G-quadruplex），具有類似辣根過氧化酶的性質(zhì)，能在過氧化氫存在下對(duì)魯米諾（luminol）、2,2-連氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）等氧化還原物質(zhì)進(jìn)行催化，催化能力較游離的hemin高出大約兩個(gè)數(shù)量級(jí)，能夠成功實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大檢測(cè)。與蛋白酶相比較，G-四鏈體-卟啉鐵更易于修飾到DNA序列中或與其它分子上，成本低，穩(wěn)定性好、抗水解性強(qiáng)，成為一種新型的催化標(biāo)記物。此外，G-四鏈體-卟啉鐵作為催化標(biāo)記基團(tuán)，由于其自身是核酸，在某種程度上減少了對(duì)蛋白等分子的非特異性吸附，進(jìn)一步提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性。同時(shí)，該辣根過氧化物模擬酶的核苷酸序列可以按照需要設(shè)計(jì)，甚至任意裁剪，大大擴(kuò)大了其應(yīng)用領(lǐng)域。因此，利用卟啉鐵與富含G堿基寡核酸序列形成G-四鏈體-卟啉鐵催化結(jié)構(gòu)構(gòu)建高靈敏度傳感器具有非常重要的意義，而且該仿酶的使用避免了很多傳感器需要進(jìn)行標(biāo)記的步驟和成本，有望用于各種傳感器的設(shè)計(jì)中。

圖20 卟啉鐵和富含G堿基寡核苷酸序列構(gòu)建的G-四鏈體-卟啉鐵催化結(jié)構(gòu)Fig.20 Proposed hemin structure and guanine-quadruplex model for the folded and catalytically active structure of the hemin/G-quadruplex

基于此，Tang等[71]通過雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)將富含有G堿基的寡核酸鏈結(jié)合在一DNA長(zhǎng)雙鏈上構(gòu)建了基于G-四鏈體-卟啉鐵電催化放大的仿單酶放大系統(tǒng)。富含有G堿基的寡核苷酸鏈與卟啉鐵hemin結(jié)合后形成辣根過氧化物模擬酶，在過氧化氫存在下有效催化電活性物質(zhì)二茂鐵的氧化還原反應(yīng)。Zhou等[72]利用寡核甘酸互補(bǔ)鏈連接法將G-四鏈體-卟啉鐵催化結(jié)構(gòu)修飾在電極表面構(gòu)建了電催化放大的microRNA電化學(xué)傳感器。Shen等[73]直接將凝血酶適體固定在電極表面，利用凝血酶適體能與卟啉鐵hemin結(jié)合形成催化結(jié)構(gòu)構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單的用于凝血酶檢測(cè)的電化學(xué)適體傳感器。Zhang等[74]設(shè)計(jì)了一條含有大量G堿基的細(xì)胞因子適體，在沒有目標(biāo)分析物細(xì)胞因子時(shí)，細(xì)胞因子適體自身部分發(fā)生堿基配對(duì)。而當(dāng)結(jié)合細(xì)胞因子后，配對(duì)的雙鏈解開，裸露出一段富含G堿基序列與卟啉鐵hemin結(jié)合形成G-四鏈體-卟啉鐵催化結(jié)構(gòu)，從而成功構(gòu)建了電催化放大電化學(xué)適體傳感器（圖21）。

圖21 基于G-四鏈體-卟啉鐵模擬酶電催化放大檢測(cè)細(xì)胞因子的免標(biāo)記型電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[74]Fig.21 Label-free and amplified electrochemical detection of cytokine based on hairpin aptamer and catalytic DNAzyme[74]

3.3 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)信號(hào)放大技術(shù)在電化學(xué)適體傳感器中的應(yīng)用

雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （hybridization chain reaction, HCR）是2004年由Dirks和Pierce[75]提出的一種檢測(cè)靈敏度類似聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的信號(hào)放大技術(shù)。它是一個(gè)無酶參與的反應(yīng)過程，通過設(shè)計(jì)合理的不同寡核苷酸，由一小段核苷酸鏈作為引發(fā)劑誘導(dǎo)寡核苷酸相互雜交形成一條具有二維或三維空間結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA。由于它是引發(fā)劑引起的反應(yīng)，可以有效減少假陽信號(hào)，降低背景電流。此外，每一引發(fā)劑可以觸發(fā)一個(gè)HCR反應(yīng)形成長(zhǎng)鏈dsDNA,致使許多寡核苷酸連接在一起，在電化學(xué)傳感器信號(hào)放大方面顯示出了巨大的潛力。Chen等[76]利用雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)信號(hào)放大技術(shù)構(gòu)建了超靈敏電致化學(xué)發(fā)光傳感器（圖22）。通過雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)得到的長(zhǎng)鏈dsDNA能將大量的發(fā)光物質(zhì)嵌入其中，大大提高了傳感器靈敏度。Chen等[77]同樣也利用雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成dsDNA結(jié)合電活性物質(zhì)氨基釕構(gòu)建了簡(jiǎn)單、靈敏的免標(biāo)記型電化學(xué)傳感器。由于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)不需要酶的加入，以核苷酸鏈作為引發(fā)劑誘導(dǎo)鏈聚合，反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)單，可適用于其他傳感器的信號(hào)放大。

圖22 基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)信號(hào)放大的免標(biāo)記型電致化學(xué)發(fā)光傳感器原理示意圖[76]Fig.22 Scheme of the principle for the label-free ECL biosensor with hybridization chain reaction amplification[76]

Zhao等[78]將雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和酶標(biāo)記信號(hào)放大技術(shù)連用構(gòu)建了多重信號(hào)放大電化學(xué)適體傳感器用于干擾素的測(cè)定（圖23）。通過雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)得到的長(zhǎng)鏈dsDNA標(biāo)記有大量的生物素，可以在生物素—親和素的作用下成功將堿性磷酸酶標(biāo)記在長(zhǎng)鏈dsDNA上。堿性磷酸酶具有催化特性，能催化檢測(cè)底液中磷酸鹽水解產(chǎn)生電活性物質(zhì)而形成催化放大體系。該傳感器具有高的靈敏度，對(duì)干擾素的檢出限達(dá)到了0.3 nmol/L。

3.4 目標(biāo)循環(huán)信號(hào)放大技術(shù)在電化學(xué)適體傳感器中的應(yīng)用

目標(biāo)循環(huán)是近年來快速發(fā)展起來的一種信號(hào)放大技術(shù)，被越來越多的用于基礎(chǔ)理論的研究和臨床實(shí)際樣品檢測(cè)中。目標(biāo)循環(huán)信號(hào)放大技術(shù)是利用內(nèi)切酶或者外切酶將與目標(biāo)分析物等結(jié)合的適體或其互補(bǔ)鏈切斷，釋放出目標(biāo)分析物或互補(bǔ)鏈，釋放出的目標(biāo)分析物或互補(bǔ)鏈進(jìn)行下一個(gè)結(jié)合—剪切循環(huán)，經(jīng)過不斷的重復(fù)利用，達(dá)到信號(hào)放大的效果。自Kiesling等[79]利用內(nèi)切酶結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光聯(lián)合毛細(xì)管電泳進(jìn)行目標(biāo)循環(huán)信號(hào)放大檢測(cè)后，該信號(hào)放大技術(shù)在電化學(xué)方法上得到了快速的發(fā)展。Cao等[80]基于小分子目標(biāo)分析物連接適體和核酸內(nèi)切酶構(gòu)架了新型電化學(xué)傳感器（圖24）。在該傳感器中，小分子目標(biāo)分析物與適體結(jié)合后能有效保護(hù)核酸內(nèi)切酶對(duì)適體的破壞。利用適體能與修飾在電極表面的互補(bǔ)鏈捕獲探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，將小分子目標(biāo)分析物和適體修飾在電極表面。此時(shí)核酸內(nèi)切酶對(duì)適體進(jìn)行剪切釋放出互補(bǔ)鏈捕獲探針，用于結(jié)合更多的小分子目標(biāo)分析物和適體。這個(gè)過程導(dǎo)致電極表面空間位阻減少，得到增強(qiáng)的電化學(xué)信號(hào)。實(shí)驗(yàn)表明，該傳感器對(duì)小分子葉酸受體目標(biāo)分析物的檢測(cè)范圍為0.3～5 ng/mL，檢測(cè)線為0.19ng/mL。Tong等[81]基于外切酶催化目標(biāo)分析物循環(huán)放大構(gòu)建了用于高靈敏檢測(cè)赭曲霉素的電化學(xué)適體傳感器。赭曲霉素適體與赭曲霉素結(jié)合后離開電極表面進(jìn)入溶液并釋放出二茂鐵標(biāo)記的互補(bǔ)單鏈，二茂鐵距離電極表面距離縮短，得到較強(qiáng)的電化學(xué)信號(hào)。此時(shí)，利用外切酶將溶液中與赭曲霉素結(jié)合的適體破壞并釋放出赭曲霉素，而釋放出的赭曲霉素又能與電極表面的適體結(jié)合，釋放出更多二茂鐵標(biāo)記的互補(bǔ)單鏈，使得電化學(xué)信號(hào)大大增強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度得到了有效的提高。

圖23 基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和酶標(biāo)記雙重信號(hào)放大的干擾素電化學(xué)適體傳感器[78]Fig.23 Scheme of electrochemical aptasensor based on hybridization chain reaction with enzyme-signal amplification for interferon-gamma detection[78]

圖24 基于核酸內(nèi)切酶信號(hào)放大的電化學(xué)適體傳感器[80]Fig.24 Scheme of electrochemical aptasensor based on nicking endonuclease-assisted amplification[80]

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Studies on electrochemical aptasensor for thrombin dectrion

Yuan Ya-li,Yuan Ruo,Chai Ya-qin*
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)

Thrombin,a kind of serine protease that involved in thrombosis and hemostasis,plays an important role in revealing tumorigenesis mechanism and judgment of early diagnosis,curative effect and prognosis.Since the concentration of thrombin in blood reaches to nmol/L,create a simple,rapid and high-sensitivity method for detection of thrombin is extremely important.Electrochemical aptasensor,the combination of SELEX-screened aptamers and electrochemical sensors,integrates the advantages of high sensitivity,fast response,simple operation and low cost of electrochemical sensors as well as high selectivity and specificity of aptamer,which thus provids very broad application prospects in the field of thrombin detection.Here,after general introduction of aptamer including its in vitro selection,characteristic and interaction with thrombin,the principles,classification,immobilization method and associated electrochemical analysis techniques of the electrochemical aptasensor were described in detail.Moreover,the application of signal amplificatory strategy for electrochemical aptasenor was highlighted.

nanomaterial;biosensor;electrochemical;application

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21075100，21275119)

*通訊聯(lián)系人,E-mail:yqchai@swu.edu.cn