汪小平，王向紅,2,?

（1.溫州大學(xué)物理與電子信息工程學(xué)院學(xué)院，浙江溫州 325035；

2.溫州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江溫州 325035）

亞精胺對誘導(dǎo)DNA凝聚行為的影響研究

汪小平1，王向紅1,2,?

（1.溫州大學(xué)物理與電子信息工程學(xué)院學(xué)院，浙江溫州 325035；

2.溫州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江溫州 325035）

利用原子力顯微鏡技術(shù)（AFM）研究了亞精胺加入次數(shù)及不同培養(yǎng)時間對DNA凝聚行為的影響.研究表明，DNA的凝聚行為取決于亞精胺的加入次數(shù)和培養(yǎng)時間.隨著加入次數(shù)的增加，DNA凝聚減慢、凝聚體尺寸變大；隨著培養(yǎng)時間的增加，DNA凝聚體變得越來越緊湊.本研究可為DNA凝聚行為的藥理特性和生物學(xué)效應(yīng)提供科學(xué)依據(jù).

AFM；亞精胺；DNA凝聚；加入次數(shù)；培養(yǎng)時間

在特定的時期，活細胞控制著DNA的凝聚和解聚任務(wù)，例如在細胞生命周期內(nèi)遺傳密碼使得基因得以表達[1-2]，同時長鏈DNA儲存在微米大小的區(qū)域內(nèi)[3].在基因的復(fù)制和傳遞過程中，這種凝聚機制是一種很重要的保護機制，從外部保護了遺傳信息的安全性.研究DNA凝聚的詳細過程可以幫助我們了解DNA如何被組織染色，以及如何發(fā)展成基因運載工具[4].近年來，科學(xué)家對DNA凝聚做了大量研究.在體外實驗中，Gosule等[6]通過電子顯微鏡首次觀察到在缺少ATP和蛋白質(zhì)的存在下，正三價的亞精胺可直接誘導(dǎo)DNA凝聚成為環(huán)狀、棒狀的結(jié)構(gòu).Wilson等[7]通過光散射手段研究了同價態(tài)的陽離子，如Na+、Mg2+、正三價的亞精胺和正四價的精胺對DNA凝聚的影響.事實上，多價陽離子[8-10]、酒精[11]、蛋白質(zhì)[12]、中性的凝聚聚合物[13]和一些抗癌藥物[14]都可以誘導(dǎo)DNA凝聚成不同的形態(tài).但是值得注意的是，多價陽離子誘導(dǎo)DNA凝聚過程與生物體內(nèi)的DNA有序存儲過程有著許多共同特征，該凝聚主要取決于多價陽離子的價數(shù)，而不是多價陽離子的結(jié)構(gòu)[15].研究還發(fā)現(xiàn)，使DNA凝聚的凝聚體的大小除了取決于采用的凝聚劑外，還受陽離子的濃度和添加時間的影響.同時，在不同培養(yǎng)時間[16]，不同濃度下形成的不同形態(tài)的十二烷基溴凝聚體，最后可以釋放成原始形式[17].

本文利用原子力顯微鏡技術(shù)（AFM）研究了不同亞精胺加入次數(shù)和樣品不同培養(yǎng)時間對DNA凝聚行為的影響，分析DNA在亞精胺作用下凝聚行為的變化，為亞精胺誘導(dǎo)DNA凝聚行為的藥理特性和生物學(xué)效應(yīng)提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 試劑

λ-DNA（DNA濃度為500 ng/μL，儲存條件為：100 m mol/L，Tris-HCl，pH 8.0，10 m mol/L NaCl，1 m mol/L EDTA），亞精胺（100 μ mol，C7H19N3?3HCl，Mr 254.6），購自華美生物工程公司（分析純），純水（18.2 m?cm）是經(jīng)過密理博超純化系統(tǒng)去離子與凈化處理.

1.2 DNA凝聚體樣品的制備

先分別加120 μL水、1.2 μL DNA到A、B、C、D無菌管中.A管不加亞精胺；B管一次性加入亞精胺60 μL；C管先加亞精胺30 μL，20 min后再加入亞精胺30 μL；D管先加入亞精胺10 μL，然后每隔20 min加10 μL亞精胺，直到加完60 μL亞精胺為止.靜置10min.見圖1.

圖1 不同陽離子加入次數(shù)示意圖

1.3 AFM觀察

分別從A、B、C、D管底部取8 μL溶液，滴加到新鮮解離的云母片表面.約3 min后，用氮氣吹干，然后用AFM進行觀察.AFM參數(shù)：微懸臂長為200 μm，力常數(shù)為0.12 N/m，掃描速度一般為3.0 – 5.0 Hz，成像模式為接觸式，圖像采集為height方式.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同陽離子加入次數(shù)下DNA凝聚行為

用AFM對凝聚體進行觀測時，制樣過程快速、簡單，僅涉及到DNA吸附到云母基底的快速干燥過程.因此，我們所觀測的結(jié)果基本上能代表凝聚體在溶液中的固有狀態(tài).

圖2所示是未添加亞精胺的DNA的AFM圖像，從圖中可以看出，由溶液的自由狀態(tài)直接吸附到云母基底的DNA分子呈線性舒展?fàn)顟B(tài).圖3所示是在不同的亞精胺陽離子加入次數(shù)（垂直）和不同的培養(yǎng)時間（水平）下，用原子力顯微鏡觀察亞精胺誘導(dǎo)的DNA凝聚體圖像.由圖2和圖3的形貌對比我們可以知道，加入亞精胺前后DNA的狀態(tài)有明顯不同，加入亞精胺后DNA由圖2的線性舒展形式變?yōu)榫W(wǎng)狀或者球狀凝聚體形式，這表明亞精胺可以誘導(dǎo)DNA凝聚.

圖2 未添加亞精胺的DNA的AFM圖

圖3表示不同的亞精胺陽離子加入次數(shù)與不同的培養(yǎng)時間情況下，亞精胺誘導(dǎo)DNA凝聚的AFM圖象（掃描范圍為5 μm×5 μm）.從圖3可以看出，線性舒展的DNA在亞精胺加入1 min后迅速開始凝聚，說明亞精胺的加入起到了決定作用.當(dāng)亞精胺（陽離子）的加入次數(shù)不同時，凝聚劑與DNA形成的凝聚體在結(jié)構(gòu)和尺寸上表現(xiàn)不同.當(dāng)亞精胺加入次數(shù)為1時，自由伸展的DNA在亞精胺加入的最初1 min內(nèi)迅速開始凝聚，而且分布比較均勻.當(dāng)培養(yǎng)時間為15 min時，DNA局部凝聚成網(wǎng)狀凝聚結(jié)構(gòu).當(dāng)培養(yǎng)時間更長，為60 min時，所有的DNA鏈全部坍塌成球狀結(jié)構(gòu).當(dāng)亞精胺加入次數(shù)為2時，DNA鏈在1 min時也快速凝聚，但是DNA凝聚體更緊湊；隨著培養(yǎng)時間的增加，DNA鏈折疊成小片，然后那些微小的小片結(jié)合成串狀；經(jīng)過長時間的模擬，為60 min時，所有的DNA分子鏈凝聚成緊湊的球狀結(jié)構(gòu).當(dāng)亞精胺加入次數(shù)為6時，DNA在亞精胺加入的1 min內(nèi)凝聚成很緊湊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)培養(yǎng)時間為15 min時，緊湊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)開始減小，最后當(dāng)培養(yǎng)時間達到60 min時，DNA全部凝聚成了尺寸很小但是很緊湊的球狀結(jié)構(gòu).

圖3 不同的亞精胺加入次數(shù)與不同的培養(yǎng)時間情況下, 亞精胺誘導(dǎo)DNA凝聚的AFM圖象

亞精胺的加入次數(shù)不同，凝聚過程是不一樣的.其中陽離子的加入次數(shù)最少（1次）的情況下，DNA自由伸展的時間比較短，DNA凝聚的比較快，亞精胺一加入，DNA鏈很快凝聚，沒有時間弛豫，凝聚體尺寸比較小，最后凝聚成尺寸比較小的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；陽離子的加入次數(shù)最多（6次）的情況下，DNA凝聚的比較慢，一邊弛豫一邊凝聚，凝聚體尺寸比較大，最后導(dǎo)致DNA凝聚成尺寸比較大的球狀結(jié)構(gòu).

2.2 不同培養(yǎng)時間下的DNA凝聚行為

從圖3可以看出，當(dāng)培養(yǎng)時間為1 min時，一次添加亞精胺的DNA快速凝聚成了分布均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；二次添加亞精胺的DNA凝聚體呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，分布較為均勻；六次添加亞精胺的DNA也凝聚成了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但凝聚體尺寸卻比前面（見圖3中a1圖和b1圖）的大且更緊湊.當(dāng)培養(yǎng)時間為15 min時，一次添加亞精胺的DNA局部凝聚成了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，二次添加亞精胺的DNA也出現(xiàn)了分布不均勻的凝聚結(jié)構(gòu)，六次添加亞精胺的DNA凝聚體呈現(xiàn)個別比較緊湊的網(wǎng)狀機構(gòu).當(dāng)培養(yǎng)時間為60 min時，一次添加亞精胺的DNA全部坍塌成了尺寸很小的球狀結(jié)構(gòu)，二次添加亞精胺的DNA坍塌成了球狀凝聚體且凝聚體尺寸開始增大，六次添加亞精胺的DNA全部坍塌成了尺寸稍大的球狀凝聚體結(jié)構(gòu).

研究發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的增加，DNA分子的形態(tài)從比較大的緊湊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變成了較小的高度緊湊的球狀結(jié)構(gòu)，凝聚尺寸變小，凝聚體凝聚得越來越緊湊.

3 結(jié) 論

本文采用原子力顯微鏡技術(shù)研究了亞精胺誘導(dǎo)DNA凝聚行為的變化特征，得到如下結(jié)論：

（1）亞精胺可以誘導(dǎo)DNA凝聚.

（2）當(dāng)亞精胺一次加入時，DNA凝聚快，凝聚體尺寸比較小且呈現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；隨著加入次數(shù)的增加，DNA凝聚減慢，凝聚體尺寸變大且呈現(xiàn)球狀結(jié)構(gòu).

（3）隨著樣品培養(yǎng)時間不同，DNA凝聚體緊湊程度呈現(xiàn)明顯差異.

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The Effects of Spermidine on DNA Condensation Behavior

WANG Xiaoping1, WANG Xianghong1,2
（1.School of Physics and Electronic Information, Wenzhou University, Wenzhou, China 325035；
2.Wenzhou Vocational ＆Technical College, Wenzhou, China 325035）

By using atomic force microscopy （AFM）, we systematically studied the effects of spermidine-adding times and culture time on DNA condensation.The research showed that：DNA condensation strongly depends on the spermidine-adding times and culture time.With the adding times increasing, DNA condensates slowly, and DNA condensation becomes bigger；with culture time increasing, DNA condensates fast, and DNA condensation becomes more and more compact.The conclusions of this study can provide the scientific basis for the pharmacological characteristics and biological effects of DNA condensation behavior.

AFM；Spermidine；DNA Condensation；Adding Times；Culture Time

Q-336

A

1674-3563（2013）02-0024-05

10.3875/j.issn.1674-3563.2013.02.005 本文的PDF文件可以從xuebao.wzu.edu.cn獲得

（編輯：封毅）

2013-01-09

國家自然科學(xué)基金（20774066，20974081，21174131，21104060）；國家自然科學(xué)基金重點項目（20934-04）

汪小平（1988- ），女，江西吉安人，碩士研究生，研究方向：高分子物理.? 通訊作者，wangxh@wzu.edu.cn