周永恒 ，夏承來 ，段才聞 ，嚴鵬科 *，謝金魁 *(.廣州醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院藥學部，廣州 5050；.南華大學藥理研究所，湖南 衡陽 4000)

蛞蝓(Limax)是一種危害農(nóng)作物有肺的軟體動物，屬腹足類腹足綱蛞蝓科，我國各地有產(chǎn)。蛞蝓藥用在漢朝的《神農(nóng)本草經(jīng)》就已記載，此后《本草綱目》、《中藥大辭典》等均對蛞蝓有詳細論述。蛞蝓有清熱解毒、活血祛瘀、軟堅散結(jié)等功能，常用于治療咳、喘、痰嗚、咽喉腫痛、半身不遂等癥，近年研究主要在肺癌、肺氣腫、支氣管炎、支氣管哮喘等方面。殷志等[1]研究證實蛞蝓提取物LE對人肺癌A549細胞有生長抑制作用；謝金魁等[2]研究提出蛞蝓提取物EL-3抗肺癌的作用機制是多靶點復合性的；本研究組[3]研究證實蛞蝓對實驗性肺氣腫合并肺動脈高壓具有較好治療作用，蛞蝓凍干粉對急性支氣管炎有較強的鎮(zhèn)咳和祛痰作用[4]；國外研究者僅利用蛞蝓作為嗅覺和味覺神經(jīng)調(diào)控的動物模型來研究[5]。本試驗受試物蛞蝓膠囊是以廣西百色地區(qū)足襞蛞蝓為原料制備的勻漿凍干制劑，按《藥品注冊管理辦法》注冊分類，屬中藥2類新藥。目前國內(nèi)外未見有蛞蝓膠囊長期毒性研究的文獻報道，本試驗旨在按《中藥、天然藥物長期毒性研究技術(shù)指導原則》[6]和《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》開展蛞蝓膠囊對大鼠的長期毒性研究，探討蛞蝓膠囊重復用藥的長期毒性，為后期的臨床研究提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物

蛞蝓膠囊(南華大學藥物藥理研究所研制，批號：20101015)，臨床應用途徑為口服，預期人臨床劑量 11.0 mg·kg-1·d-1，推薦臨床用藥時間為60 d。實驗時取膠囊內(nèi)容物蛞蝓凍干粉用 0.9%生理鹽水配制成溶液供灌胃使用。

1.2 動物

SD大鼠，清潔級，♀♂各半，體質(zhì)量(75.0±8.6)g，來源于湖南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK(湘)2003-0003。

1.3 儀器與試劑

BECKMAN全自動生化分析儀(德國BECKMAN公司)；日立7110型血細胞分析儀(日本日立)；FA1004型電子天平(上海天平儀器廠)；1512型組織切片機(德國來卡公司)；OLYMPUSCH顯微鏡攝影系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)。

血細胞檢測稀釋液(中科院中生公司，批號：1002016)；血液生化檢測試劑分別為：血糖、總蛋白、總膽固醇、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶、肌酐、尿素氮(北京中生生物工程高技術(shù)公司產(chǎn)品，批號分別為：100202，100401，100125，100213，100217，100201，100201)。

2 方法

2.1 劑量設定

預期人臨床劑量 11.0 mg·kg-1·d-1，按標準動物的等效劑量折算系數(shù)法計算出大鼠劑量為 70.0 mg·kg-1·d-1[7]。大鼠長期毒性試驗原則上低劑量大于等效劑量或者最低有效劑量，高劑量一般為低劑量的10倍左右，中劑量為高、低劑量的對數(shù)中位數(shù)[8]，計算出低、中、高劑量(175.0，553.0，1 750.0 mg·kg-1)。

2.2 動物分組、給藥、飼養(yǎng)與抽樣

取SD大鼠160只，♀♂各半，將動物適應環(huán)境飼養(yǎng)2周，均衡隨機分成4組，每組40只。4組大鼠分別給 0.9%生理鹽水(對照組)，蛞蝓膠囊175.0，553.0，1 750.0 mg·kg-1，給藥容積均為 10.0 mL·kg-1；每日上午 9∶00~10∶00 定時 1 次灌胃給藥，每周給藥6 d，連續(xù)給藥26周，并停藥觀察4周。每周根據(jù)大鼠體質(zhì)量變化調(diào)整給藥量。動物在清潔級動物室中飼養(yǎng)，喂全價顆粒飼料，飲冷開水；實驗室溫度19~24 ℃，濕度50%~70%。于第13周給藥后夜間禁食，自由飲水。次日每組取♀♂各5只測各項指標；試驗結(jié)束時(26周)每組取♀♂各10只測各項指標；恢復期觀察1個月(4周)，每組取剩余動物測各項指標。

2.3 檢測指標

①一般觀察指標。給藥期間，每日觀察動物存活、外觀、行為、活動、毛色、精神狀態(tài)、呼吸、糞便情況；每周稱實驗動物體重 1次；每周稱剩余飼料并計算平均每日每只大鼠進食量。②血液學、生化學和尿常規(guī)檢測。分別于給藥第 13周、26周和恢復期4周后，進行血液學指標[紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)、血紅蛋白計數(shù)及分類、淋巴細胞(LYM)、中性粒細胞(GRAN)、單核細胞(MID，含單核細胞、嗜酸性細胞、嗜堿性細胞及其他白細胞前體)、血小板(PLT)、出凝血時間(CT、PT)]、生化學指標[谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、肌酐(UREA)、總膽固醇(CHOL)、甘油三脂(TG)、血糖(GLU)、肌酸激酶(CK)，鉀(K)]和尿液分析(尿膽原、膽紅素、酮體、隱血、蛋白質(zhì)、葡萄糖、pH、亞硝酸鹽、紅細胞、白細胞)。③解剖學、病理學檢查，分別于第13周、第26周、恢復期4周，處死各組部分動物進行系統(tǒng)解剖學和病理組織學檢查。

2.4 統(tǒng)計學分析

體質(zhì)量、攝食量、血液學、血清生化學指標和臟器系數(shù)均為計量資料，用±s 表示，根據(jù)方差分析結(jié)果，各組之間進行t檢驗。用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，比較給藥組與對照組均數(shù)的統(tǒng)計學差異。

3 結(jié)果

3.1 對大鼠一般狀況、行為活動及死亡的影響

試驗期間各組與對照組比較，各給藥組在給藥26周和恢復期4周的觀察中，外觀、行為、活動毛色、精神狀態(tài)、呼吸、糞便的性狀等均無明顯改變。對照組、給藥各組在給藥前、給藥 1~26周、恢復期4周內(nèi)均無動物死亡。

3.2 對大鼠體質(zhì)量的影響

試驗期間各組動物體質(zhì)量均有增長，與對照組比較，各給藥組在給藥26周和恢復期4周期間大鼠體質(zhì)量均無明顯影響，給藥組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

3.3 對大鼠進食量的影響

與對照組比較，各給藥組在給藥期和恢復期期間大鼠進食量均無明顯影響，給藥組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

3.4 對一般血液學指標的影響

與對照組比較，各給藥組在實驗中期、實驗末期和停藥恢復期 4周期間，各項血液學指標(RBC、WBC，血紅蛋白計數(shù)及分類，LYM，GRAN，MID，PLT，CT、PT)差異無統(tǒng)計學意義(P 均>0.05)。

3.5 對大鼠血液生化指標的影響

與對照組比較，各給藥組在實驗中期、實驗末期和停藥恢復期4周期間，各項生化指標(ALT，AST，TP，BUN，UREA，CHOL，TG，GLU，CK，K)差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

3.6 對大鼠尿液的影響

與對照組比較，各給藥組在實驗前、實驗中期、實驗末期和停藥恢復期 4周期間，大鼠尿液各項指標(尿膽原、膽紅素、酮體、隱血、蛋白質(zhì)、葡萄糖、pH、亞硝酸鹽、紅細胞、白細胞)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3.7 對大鼠臟器系數(shù)的影響

于實驗中期、實驗結(jié)束時、停藥恢復期觀察4周后，處死各組部分動物進行系統(tǒng)解剖檢查發(fā)現(xiàn)：各組動物發(fā)育良好，口、鼻、眼、耳未見異常分泌物，各臟器(腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、睪丸、附睪、子宮、卵巢)肉眼未見明顯形態(tài)學改變。給藥組與對照組比較，各臟器系數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3.8 對大鼠臟器病理組織學的影響

在給藥的第13、26周和恢復期4周，取動物臟器用 10%甲醛溶液固定，其中對照組和高劑量組器官予石臘包埋，常規(guī)切片、HE染色，用OLYMPUS-CH顯微鏡攝影系統(tǒng)進行病理組織學檢查。肉眼觀察，組織表面與切面均未見異常改變。腦、垂體、脊髓、胸腺、甲狀腺、甲狀旁腺、食管、唾液腺、胃、小腸、大腸、肝、胰腺、腎、腎上腺、脾、心、氣管、肺、主動脈、睪丸、附睪、前列腺、子宮、乳腺、卵巢、膀胱、坐骨神經(jīng)、視神經(jīng)、骨髓、淋巴結(jié)等實質(zhì)性臟器給藥組與對照組比較無明顯差異，未見急性和慢性中毒性損傷樣病理改變。

4 討論

長期毒性試驗是藥物非臨床安全性評價的核心內(nèi)容，是藥物從藥學研究進入臨床試驗的重要環(huán)節(jié)。本試驗通過大鼠重復給藥表征蛞蝓膠囊的毒性作用，預測其可能對人體產(chǎn)生的不良反應，降低臨床試驗受試者和藥品上市后使用人群的用藥風險。實驗結(jié)果蛞蝓膠囊按低劑量 175.0 mg·kg-1、中劑量 553.0 mg·kg-1、高劑量 1 750.0 mg·kg-1給大鼠連續(xù)灌胃給藥 26周，停藥恢復 4周，給藥組與對照組比較，大鼠的外觀體征、腺體分泌、呼吸、糞便、飼料的日消耗量、給藥局部反應等均未見異常。給藥組體質(zhì)量增長正常，血常規(guī)及血液生化檢查，與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義。主要臟器的病理組織學檢查，未見因藥物毒性引起的明顯病理改變。結(jié)果提示：蛞蝓膠囊對大鼠灌胃給藥的安全劑量是 1 750.0 mg·kg-1。

本次實驗的高劑量 1 750.0 mg·kg-1按千克體質(zhì)量折算相當于70 kg成人臨床用藥劑量159倍，一般認為，按體質(zhì)量計算，大鼠1 d內(nèi)最大給藥量相當于成人臨床日用劑量的 100倍以上是較安全的[9]。綜上所述，蛞蝓膠囊對大鼠長期反復用藥無明顯的毒性作用，可預測臨床劑量以 11.0 mg·kg-1·d-1，連續(xù)用藥為 60 d，是比較安全的。

[1]YIN Z, ZHUANG Y Z, CAO J G, et al. Inhibition effect of Limax extract in growth of A549 cell line and tumorigenicity in mice [J]. J Nanhua Univ(Med Ed)(南華大學學報 醫(yī)學版),2009, 37(1): 45-47.

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