曾令麗

（四川省德陽(yáng)市人民醫(yī)院兒科 618000）

原發(fā)性腎病綜合征（primary nephrotic syndrome，PNS）是由于腎小球基底膜通透性增加，導(dǎo)致大量蛋白尿、低清蛋白血癥以及一系列病理、生理改變的臨床綜合征，學(xué)齡前兒童為該病的高發(fā)人群。研究報(bào)道，兒童PNS發(fā)病率和患病率分別為（2～4）／10萬(wàn)和16／10萬(wàn)，兒科住院泌尿系統(tǒng)疾病患兒中PNS約占20%～30%，且具有增多趨勢(shì)［1-2］。目前，兒童PNS的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，多數(shù)研究認(rèn)為與其免疫功能紊亂有關(guān)［3-4］。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)激素治療前、后兒童PNS患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化，探討其在兒童PNS發(fā)病機(jī)制中的作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年11月至2012年8月在本院兒科診斷和治療的PNS患兒47例，根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)2009年腎臟病學(xué)組修訂的PNS診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］分為單純型腎病（SNS）和腎炎型腎?。∟NS），同時(shí)選擇在本院兒童保健科體檢的22例健康兒童作為正常對(duì)照組。研究對(duì)象一般情況比較見表1。

1.2 試劑與儀器 FITC／PE標(biāo)記的單克隆抗體：CD3-FITC／CD16＋56-PE、CD4-FITC／CD8-PE、CD3-FITC／HLADR-PE、CD4-FITC／CD25-PE和CD19-PE（Immunotech公司，法國(guó)）；美國(guó)Beckman coulter XL型流式細(xì)胞分析儀。

1.3 方法

1.3.1 治療方法 兩組患者給予相同的治療即誘導(dǎo)緩解階段給予潑尼松每天2mg／kg，分2次口服；待尿蛋白轉(zhuǎn)陰后，每晨頓服，持續(xù)6周。鞏固維持階段隔日晨頓服每天1.5mg／kg，持續(xù)6周；當(dāng)尿蛋白持續(xù)陰性時(shí)，逐漸減量。潑尼松足量每天2mg／kg，治療小于4周，尿蛋白轉(zhuǎn)陰者判定為緩解即激素敏感型PNS；以潑尼松足量治療大于4周，尿蛋白仍陽(yáng)性者判定為未緩解即激素耐受型PNS。

1.3.2 標(biāo)本采集 所有研究對(duì)象在入院時(shí)首次采空腹靜脈血2mL，檢測(cè)淋巴細(xì)胞各亞群比例；待激素治療后尿蛋白連續(xù)3次檢查陰性，血清蛋白恢復(fù)正常水平后再次采血復(fù)查。

1.3.3 檢測(cè)指標(biāo) 各取100μL待測(cè)血樣分別加入CD3-FITC／CD16＋56-PE、CD4-FITC／CD8-PE、CD4-FITC／CD25-PE、CD19-PE標(biāo)記的單克隆抗體，然后嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書處理樣本后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3＋（總T細(xì)胞）、CD3＋CD4＋（輔助性T細(xì)胞）、CD3＋CD8＋（細(xì)胞毒性T細(xì)胞）、CD4＋CD25＋（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）、CD19＋（B細(xì)胞）和CD3＋CD56＋（NK細(xì)胞）百分率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK法，組內(nèi)前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 研究對(duì)象治療前活動(dòng)期各淋巴細(xì)胞亞群比較 與正常對(duì)照組比較，SNS組和NNS組患兒外周血CD3＋CD4＋、CD4＋CD25＋和NK細(xì)胞比例均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；CD3＋CD8＋和B細(xì)胞比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。SNS組和NNS組患兒外周血各淋巴細(xì)胞亞群間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.2 激素治療前、后各淋巴細(xì)胞比例變化情況 經(jīng)激素治療后，PNS患兒有39例得到緩解，未緩解8例，激素敏感率為82.98%；SNS組有28例（90.32%）患兒得到緩解；NNS組有11例（68.75%）患兒得到緩解。與治療前比較，治療后SNS組和NNS組緩解患兒外周血CD3＋CD8＋和B細(xì)胞比例均明顯下降（P＜0.05），CD3＋CD4＋、CD4＋CD25＋和 NK細(xì)胞比例顯著升高，而未緩解患兒各淋巴細(xì)胞亞群變化比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療后SNS組和NNS組緩解患兒外周血CD3＋、CD3＋CD4＋、CD4＋CD25＋和 NK細(xì)胞比例低于正常對(duì)照組（P＞0.05），CD3＋CD8＋和B細(xì)胞比例高于正常對(duì)照組（P＞0.05），而未緩解患兒各淋巴細(xì)胞亞群變化與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05或P＜0.01），見表3。

表1 研究對(duì)象一般情況比較（±s）

表1 研究對(duì)象一般情況比較（±s）

＊：P＜0.01，與正常對(duì)照組比較；-：此項(xiàng)無(wú)數(shù)據(jù)。

組別 n性別男 女年齡（歲）尿蛋白（n）＋＋＋ ＋＋＋＋清蛋白（g／L） 膽固醇（mmol／L）正常對(duì)照組22 17 5 5.81±2.86 - - 32.36±8.71 3.89±0.92 SNS組 31 23 8 5.63±3.02 21 10 17.58±3.42＊ 6.92±2.07＊NNS組 16 12 4 5.57±2.95 11 5 18.05±4.30＊ 7.03±2.11＊F 或 χ2 0.067 2.415 0.005 5.470 5.030 P 0.967 0.103 0.944 0.004 0.008

表2 研究對(duì)象治療前活動(dòng)期各淋巴細(xì)胞亞群比較（%，±s）

表2 研究對(duì)象治療前活動(dòng)期各淋巴細(xì)胞亞群比較（%，±s）

＊：P＜0.05，＊＊：P＜0.01，與正常對(duì)照組比較。

組別 n淋巴細(xì)胞亞群CD3＋ CD3＋CD4＋ CD3＋CD8＋ CD4＋CD25＋ B細(xì)胞 NK 細(xì)胞正常對(duì)照組 22 58.69±7.33 30.84±7.38 25.90±5.21 3.94±0.41 20.41±5.68 14.03±10.83 SNS組 31 56.25±6.58 26.19±6.62＊ 28.89±6.07＊ 2.75±1.07＊＊ 26.23±7.71＊＊ 5.63±4.11＊＊NNS組 16 57.48±11.24 27.32±10.45＊ 29.03±8.69＊ 2.57±1.03＊＊ 28.09±7.32＊＊ 7.52±6.08＊＊F 2.037 2.879 4.251 5.227 5.362 7.639 P 0.115 0.036 0.026 0.007 0.006 0.000

表3 激素治療前、后各淋巴細(xì)胞亞群變化情況（%，±s）

表3 激素治療前、后各淋巴細(xì)胞亞群變化情況（%，±s）

＊：P＜0.05，＊＊P＜0.01，與治療前比較；△：P＜0.05，△△：P＜0.01，與正常對(duì)照組比較。

組別 n淋巴細(xì)胞亞群CD3＋ CD3＋CD4＋ CD3＋CD8＋ CD4＋CD25＋ B細(xì)胞 NK 細(xì)胞正常對(duì)照組 22 58.69±7.33 30.84±7.38 25.90±5.21 3.94±0.41 20.41±5.68 11.03±7.83 SNS組緩解 治療前 28 56.31±6.42 26.08±6.66 29.16±6.91 2.73±1.12 26.41±7.64 5.59±3.89治療后 28 57.16±7.02 28.53±5.97＊ 26.43±6.05＊ 3.25±1.01＊ 22.49±11.46＊ 10.46±3.93＊＊SNS組未緩解 治療前 3 56.10±6.14 26.33±6.59 28.54±5.72 2.81±1.02 26.16±6.93 5.71±4.17治療后 3 57.95±6.89 26.76±6.25△ 27.92±5.98△ 2.93±0.97△ 24.57±6.28△ 6.24±3.37△△NNS組緩解 治療前 11 57.06±10.95 27.35±10.37 29.21±7.64 2.60±0.99 27.83±7.51 7.47±6.13治療后 11 57.42±10.19 29.43±8.62＊ 26.61±8.52＊ 3.29±1.38＊＊ 22.12±6.39＊ 10.39±6.56＊＊NNS組未緩解 治療前 5 56.77±11.17 27.11±10.20 28.69±7.90 2.62±1.05 28.21±7.24 7.58±5.89治療后 5 57.01±10.75 27.69±10.04△ 27.97±8.82△ 2.76±1.12△△ 26.91±6.82△△ 8.44±5.73△△

3 討 論

3.1 各淋巴細(xì)胞亞群在PNS發(fā)病機(jī)制中的作用 PNS是兒童常見的腎臟疾病之一，約占小兒時(shí)期腎病綜合征總數(shù)的90%［6］。其發(fā)病可能與遺傳、過(guò)敏性體質(zhì)、免疫機(jī)制、炎性介質(zhì)等因素有關(guān)，多數(shù)研究表明免疫功能紊亂在PNS發(fā)病中占主導(dǎo)地位［7］。機(jī)體通過(guò)各淋巴細(xì)胞亞群間相互作用來(lái)維持免疫功能的穩(wěn)定，根據(jù)淋巴細(xì)胞表型和功能的不同分為T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等亞群。

T細(xì)胞不產(chǎn)生抗體而直接發(fā)揮免疫作用，按其免疫效應(yīng)功能分為輔助性T細(xì)胞（Th細(xì)胞）、細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL細(xì)胞）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）3個(gè)亞群。Th細(xì)胞是由CD3＋CD4＋T細(xì)胞識(shí)別MHCⅡ類分子提呈的外源性抗原肽活化后分化而來(lái)，包括Th1、Th2和Th3共3類細(xì)胞；Th1分泌IL-2、IFN-γ、TNF等細(xì)胞因子，Th2 分泌細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13等，Th3分泌TGF-β細(xì)胞因子；Th1和Th2在細(xì)胞免疫和體液免疫中發(fā)揮作用，Th3在免疫應(yīng)答中起負(fù)調(diào)節(jié)作用［8］。CTL細(xì)胞是由CD3＋CD8＋T細(xì)胞識(shí)別MHCⅠ類分子提呈的內(nèi)源性抗原肽活化后分化而來(lái)，包括Tc1和Tc2兩類細(xì)胞，Tc1和Tc2分泌的細(xì)胞因子分別與Th1和Th2相似［8］。Treg細(xì)胞可表達(dá)膜蛋白分子CD4和CD25，CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞具有免疫抑制性，可抑制CD4＋和CD8＋T細(xì)胞及B細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的分泌，在機(jī)體免疫反應(yīng)中起負(fù)調(diào)節(jié)作用［9］。本研究表明，SNS和 NNS患兒外周血CD3＋、CD3＋CD4＋、CD4＋CD25＋T細(xì)胞比例低于健康兒童，而CD3＋CD8＋T細(xì)胞比例高于健康兒童。

B細(xì)胞是由淋巴樣前體細(xì)胞分化成熟而來(lái)，可表達(dá)MHCⅠ類、Ⅱ類抗原，其與CD19、CD21等膜蛋白分子非共價(jià)相聯(lián)形成B細(xì)胞共受體，增強(qiáng)對(duì)抗原刺激的敏感性；CD19可在B細(xì)胞整個(gè)成熟過(guò)程中持續(xù)表達(dá)，其表達(dá)水平代表B細(xì)胞水平，而CD21僅在成熟B細(xì)胞表達(dá)，因此，將CD19作為分選B細(xì)胞的標(biāo)記。研究發(fā)現(xiàn)，PNS患兒外周血B細(xì)胞數(shù)明顯高于正常兒童，應(yīng)用B細(xì)胞單克隆抗體（利妥昔單抗等）可有效治療［10-11］。NK細(xì)胞即自然殺傷細(xì)胞，可經(jīng)CD2、CD3分子和細(xì)胞因子（IL-2、IFN-α、TNF-α、LR等）等多種途徑被活化而分泌細(xì)胞因子和發(fā)揮細(xì)胞毒作用，與機(jī)體抗感染、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，IgAN患兒中外周血NK細(xì)胞明顯低于正常對(duì)照組［12］；慢性腎炎以及慢性腎功能衰竭患者體內(nèi)的NK細(xì)胞活性明顯低于健康人，且腎損害越重，NK細(xì)胞活性下降越明顯［13］。本研究表明，SNS和NNS患兒外周血B細(xì)胞比例高于健康兒童，而NK細(xì)胞比例低于健康兒童。

3.2 PNS的治療方法和效果 目前，PNS治療以糖皮質(zhì)激素（GC）和細(xì)胞毒性藥物為主，其中GC為治療PNS的首選藥物。GC具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，可直接影響細(xì)胞免疫反應(yīng)的抗原識(shí)別、免疫活化、細(xì)胞增殖、免疫效應(yīng)等。研究表明，PNS患兒對(duì)GC治療的敏感性不同，GC受體基因或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其數(shù)量的異常是導(dǎo)致GC耐藥的最可能機(jī)制之一［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GC治療后PNS患兒敏感率為82.98%，SNS組敏感率為90.32%，NNS組敏感率為68.75%。經(jīng)GC治療后，SNS組和NNS組緩解患兒外周血CD3＋變化不明顯，CD3＋CD4＋、CD4＋CD25＋和NK細(xì)胞比例顯著升高，CD3＋CD8＋和B細(xì)胞比例均明顯下降，而未緩解患兒外周血各淋巴細(xì)胞亞群變化不明顯。綜上可知，CD3＋CD4＋、CD4＋CD25＋和NK細(xì)胞的下降以及CD3＋CD8＋和B細(xì)胞升高可能參與了PNS的發(fā)病過(guò)程，GC可通過(guò)改變各淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞比例而發(fā)揮治療作用。

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