陳 嫻肖麗恒

1.云南省昆明市食品藥品檢驗(yàn)所，云南 昆明 650032；2.云南省楚雄州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南 楚雄 675000

羊乳以及羊奶粉中黃曲霉毒素M1和黃曲霉毒素B1的HPLC柱后碘衍生化法檢測(cè)

陳 嫻1肖麗恒2

1.云南省昆明市食品藥品檢驗(yàn)所，云南 昆明 650032；2.云南省楚雄州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南 楚雄 675000

目的：建立羊乳以及羊奶粉中黃曲霉毒素M1和黃曲霉毒素B1含量的HPLC測(cè)定方法。方法：采用高效液相色譜儀配熒光檢測(cè)器，以Diamonsil（R）C18（250mm×4.6mm，5um）為色譜柱，流動(dòng)相為水和甲醇，流速1.0mL／min，激發(fā)波長(zhǎng)365nm，發(fā)射波長(zhǎng)435nm作為分析條件，以0.05%碘溶液為衍生化試劑。結(jié)果：黃曲霉毒素M1、B1在0～10μg／kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999；回收率均在76.5%～84.8%之間；檢出限AFM1、AFB1分別為0.05、0.02μg／kg。結(jié)論：該法具有準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適合羊乳以及羊奶粉中的黃曲霉毒素M1、B1含量的檢測(cè).

液相色譜法；黃曲霉毒素M1；黃曲霉毒素B1；羊奶；羊奶粉

黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的二氫呋喃香豆素的衍生物。是目前所發(fā)現(xiàn)的毒性最大的真菌毒素，且該毒素為黃曲霉和寄生曲霉中產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物，普遍存在于霉變的糧食及糧食制品中，可以通過多種途徑污染食品和飼料，直接或間接進(jìn)入人類食物鏈，威脅人類健康和生命安全，特別對(duì)人體及動(dòng)物內(nèi)臟器官尤其是肝臟損害嚴(yán)重。黃曲霉毒素是劇毒物質(zhì)，其毒性相當(dāng)于氰化鉀的10倍，砒霜的68倍。黃曲霉毒素肝臟毒除抑制DNA、RNA的合成外，也抑制肝臟蛋白質(zhì)的合成，長(zhǎng)期攝入黃曲霉毒素會(huì)誘發(fā)肝癌，是目前公認(rèn)的致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)之一。黃曲霉毒素主要有4種：即B1、B2、C1、G2，其中B1被認(rèn)為是主要的有毒物質(zhì)，主要存在于農(nóng)產(chǎn)品，動(dòng)物飼料，中藥等產(chǎn)品中。黃曲霉毒素M1是動(dòng)物攝入黃曲霉毒素B1后在體內(nèi)經(jīng)羥基化代謝的產(chǎn)物，一部分從尿和乳汁排出，一部分存在于動(dòng)物的可食部分，如乳、肝、蛋類、腎、血和肌肉中，其中以乳最為常見。黃曲霉毒素M1的毒性和致癌性與黃曲霉毒素B1的基本相似。

由于乳及其制品是人類，特別是嬰兒的主要食品，所以危害性更大。中國(guó)、美國(guó)規(guī)定人類消費(fèi)的乳及乳制品中的黃曲霉毒素M1含量不能超過0.5μg／kg［1］，歐盟國(guó)家規(guī)定更加嚴(yán)格，在嬰兒配方食品及改進(jìn)配方食品以及在具有特殊醫(yī)療目的的嬰兒食品中，黃曲霉毒素M1的最大限量為0.025μg／kg，要求具有特殊醫(yī)療目的的嬰兒食品中黃曲霉毒素B1的最大限量。目前黃曲霉毒素M1、B1的分析一般采用薄層色譜法（TLC）［2］、高效液相色譜法（HPLC）［3－6］、氣相色譜法 （GC）［7］、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、放射免疫檢測(cè)法［8］、以及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法［9－10］。TLC所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，具有較好的分離和專一性，在基層比較常用，但靈敏度低，步驟多，試劑耗費(fèi)大，干擾因素多，測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度的目測(cè)準(zhǔn)確性比較差，主要用于定性；ELISA靈敏度較高，快速，經(jīng)濟(jì)，但存在重復(fù)性較差、試劑壽命短、需要低溫保存等缺點(diǎn)［11］；放射免疫法的樣品前處理提取方法簡(jiǎn)便，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，只能應(yīng)用于初篩分析［8］；而國(guó)標(biāo)所用的免疫親和柱-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，特異性好，但是免疫親和柱價(jià)格昂貴，需低溫保存，凈化操作程序繁瑣［9］。因此，本文選擇水和甲醇提取，通過石油醚除脂，氯仿純化作為前處理手段，液相色譜碘衍生化熒光檢測(cè)法作為檢測(cè)技術(shù)，建立了一種操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性好、適于批量樣品檢測(cè)的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備 LC－20A島津液相色譜儀及LC－solution化學(xué)工作站；CBM－20A系統(tǒng)控制器；RF－10Axl配熒光檢測(cè)器；SIL－20AC自動(dòng)進(jìn)樣器；CTO－20AC恒溫柱溫箱；GDU－20A5真空在線脫氣機(jī)；CRB－6A柱后衍生化系統(tǒng)、在線自動(dòng)混合器；樣品均質(zhì)器；漩渦混合器 （或高速攪拌器）；高速離心機(jī)；氮?dú)獯蹈蓛x；超聲波清洗器；精密移液器；；真空抽濾泵；EasyDI8超純水機(jī)。

1.2 材料與試劑 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（10μg／mL），次氯酸鈉溶液 （50 g／L），乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑

均為分析純，水為去離子水。

1.3 色譜條件 Diamonsil（R）C18色譜柱（250mm× 4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇：水（45：55）；進(jìn)樣量：20μl；流速：1.0m L／min；激發(fā)波長(zhǎng)365nm，發(fā)射波長(zhǎng)435nm；衍生化溶液為0.05%碘溶液（避光冷藏保存）；衍生溶液流速：0.3mL／min；衍生化反應(yīng)器溫度：70℃。

1.4 樣品處理 準(zhǔn)確稱取羊乳粉試樣5.0g于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入5mL水和20 mL甲醇，漩渦混合5min后，超聲萃取10min，在6500r／min鐘下離心10min。收集上清液并移入50mL比色管中，待凈化。

準(zhǔn)確稱取羊奶試樣10.0g于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入20mL甲醇，漩渦混合5min后，超聲萃取10min，在6500r／min下離心10min。收集上清液并移入50mL比色管中，待凈化。

凈化處理：在比色管中加入20mL石油醚，再加入10mL飽和的氯化鈉溶液，振搖2 min，待分層后，棄去石油醚層。重復(fù)用石油醚提取2次，每次10mL，棄去石油醚層。在下層溶液中加入氯仿20m L，在漩渦混合2min后。待分層以后，取出氯仿層于100mL的燒杯中，再每次用10 mL氯仿提取兩次，并取出氯仿放入之前的燒杯中，在65℃水浴中將氯仿溶劑在氮吹下蒸干。用精密移液器取1mL流動(dòng)相溶解，超聲波超聲1min，過0.45 um的有機(jī)系濾膜，20μL進(jìn)樣上液相色譜儀檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇 用液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣20μL檢測(cè)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，選用乙腈和水作為流動(dòng)相時(shí)，黃曲霉毒素的色譜峰拖尾嚴(yán)重。選用甲醇和水作為流動(dòng)相，選擇甲醇和水的比例為20：80時(shí)，出峰時(shí)間比較長(zhǎng)，峰展寬較大。當(dāng)甲醇的比例增加時(shí)，黃曲霉毒素出峰時(shí)間加快，當(dāng)甲醇和水的比例為45：55時(shí)，黃曲霉毒素M1出峰時(shí)間為11.359min，黃曲霉毒素B1出峰時(shí)間為20.473min，分離效果好，出峰時(shí)間比較合理，標(biāo)樣色譜圖如圖（1）。

2.2 萃取方式的選擇 黃曲霉毒素易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有機(jī)溶劑，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。利用甲醇和水作為樣品提取溶劑，在漩渦混合使其充分混合，采用超聲波超聲提取10min，6500r／min離心10min，能夠充分的提取黃曲霉毒素，并減少蛋白的影響。

2.3 純化方法的優(yōu)化 黃曲霉毒素主要使用固相萃取柱（SPE）進(jìn)行分離純化，其固相萃取 （SPE）產(chǎn)品有兩類：一種是多功能凈化柱 （MFC），其特點(diǎn)以極性、非極性及離子交換等幾類基團(tuán)組成填充劑，可選擇性吸附樣液中的脂類、蛋白類等雜質(zhì)，黃曲霉毒素不被吸附而直接通過，從而達(dá)到凈化目的。另一是免疫親和柱 （IAC），其特點(diǎn)是將特異性的黃曲霉毒素單克隆抗體與載體蛋白偶聯(lián)并填柱而成。由于抗原抗體有一一對(duì)應(yīng)的特異性吸附關(guān)系，所以IAC只能特效性地、高選擇性地吸附黃曲霉毒素，而讓其它雜質(zhì)通過柱子，使樣品得以純化。這種吸附又可以被極性有機(jī)溶劑洗脫，進(jìn)行定量檢測(cè)［9］。使用SPE進(jìn)行分離純化，價(jià)格昂貴，并且只能使用一次。于是本實(shí)驗(yàn)利用黃曲霉毒素不溶于石油醚的性質(zhì)，用石油醚除去樣品溶液中的脂肪，再進(jìn)一步使用氯仿提純，使能溶于水而不溶于氯仿的雜質(zhì)分離，純化了樣品溶液，減少了雜質(zhì)在檢測(cè)時(shí)的干擾。

2.4 校準(zhǔn)曲線和檢出限 取黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，并配置濃度為0.1μg／L、0.5μg／L、1.0μg／L、5.0μg／L、10.0μg／L的標(biāo)準(zhǔn)混合液，在選定的色譜條件下，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系良好，校準(zhǔn)曲線和檢出限如表1。

表1 黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

2.5 加樣回收試驗(yàn)和精密度 樣品中加入0.5、2.5、5.0μg／L黃曲霉毒素M1、B1，回收率在76.5%～84.8%，精密度在2.44%～4.18%，滿足實(shí)驗(yàn)方法要求。加樣回收率和精密度見表2。羊奶粉所做空白圖如圖2，羊奶粉加標(biāo)圖3。

Determination of Aflatoxin M1 and B1 in goat milk and goat milk powder by HPLC

CHEN Xian1，XIAO Li-heng2
（1.Kunming food and drug administration，Kunming 650032，China；2.Chuxiong quality of the technical supervision and inspection center，Chuxiong 675000，China）

Objective To establish the method for the determination of two aflatoxin in goat milk and goat milk powder by HPLC. Method The analyse equipment included the HPLC instrument and Diamonsil（R）C18 chromatogram（250mm*4.6mm，5um）. The flowing phase is water and CH3OH and the rate is1.0 mL／min，excitating wave is365nm，emissing wave is435nm，the derived reagent is 0.05%Iodine solution.Result The linearity of AFM1 and AFB1 quantity between 0～10μg／kg were good.The correlation relativity was all above 0.999；The ratio of callbacking of two aflatoxin were all between 76.5%～84.8%.The determining limits of AFM1 and AFB1 in the samples were 0.05 and 0.02ug／kg.Conclusion The method is exact、sensitive and repletion is very good，It can be used to determine the quantity of AFM1 and AFB1 in the goat milk and goat milk powder.

HPLC；SFM1；AFB1；goat milk；goat milk powder

表2 樣品中黃曲霉毒素添加回收率和精密度 （n＝5）

R917

A

1007－8517（2013）13－0033－03