金巖,宋揚(yáng),陳沉

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院營養(yǎng)研究所,山東青島 266021)

刺參酸性黏多糖對人肝癌Hep G2細(xì)胞增殖的影響

金巖,宋揚(yáng),陳沉

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院營養(yǎng)研究所,山東青島 266021)

目的了解刺參酸性黏多糖(SJAMP)對體外培養(yǎng)的人肝癌Hep G2細(xì)胞增殖的影響。方法體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞,MTT法檢測SJAMP對細(xì)胞增殖的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期,免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá),以正常肝細(xì)胞(張氏細(xì)胞)作為對照。結(jié)果SJAMP能抑制Hep G2細(xì)胞增殖,且隨著干預(yù)劑量(0、0.5、2.0、8.0 mg/L)和干預(yù)時(shí)間(12、24、48 h)延長其抑制作用增強(qiáng)(F＝68.430～596.680,q＝3.714～55.029,P＜0.05);不同濃度SJAMP作用對張氏細(xì)胞增殖無明顯的抑制作用(P＜0.05)。隨著SJAMP劑量的增加,Hep G2細(xì)胞停留在G1期比例增加,S期、G2期的細(xì)胞減少(F＝4.483～18.791,q＝1.921～9.876,P＜0.05);對于張氏細(xì)胞,SJAMP作用后其細(xì)胞周期未發(fā)生顯著改變(P＞0.05)。SJAMP作用后HepG2細(xì)胞的PCNA表達(dá)降低,且隨著SJAMP作用劑量的增加而降低(F＝2 688.640,q＝55.365～156.296,P＜0.05);張氏細(xì)胞PCNA表達(dá)未發(fā)生顯著變化(P＞0.05)。結(jié)論SJAMP通過誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期G1期阻滯并抑制其PCNA表達(dá),從而抑制Hep G2細(xì)胞增殖,發(fā)揮抗腫瘤作用。

多糖;刺參屬(動(dòng)物);肝腫瘤;細(xì)胞增殖

刺參酸性黏多糖(SJAMP)為海洋腔腸類動(dòng)物體內(nèi)富含的一類天然海洋活性物質(zhì)。近來研究表明,SJAMP具有抗腫瘤活性,成為抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)[1]。目前,國內(nèi)外對SJAMP抗腫瘤作用的研究多集中在其對機(jī)體免疫系統(tǒng)作用方面[2-4],其對腫瘤的直接抑制作用研究較少。我們的前期研究結(jié)果顯示,SJAMP對二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)的大鼠肝腫瘤具有抑制作用,能夠降低其腫瘤發(fā)生率[5],但SJAMP直接作用于肝腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的作用及其機(jī)制尚待探討。本研究以人肝癌細(xì)胞株Hep G2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株,人正常肝細(xì)胞(張氏細(xì)胞)株為對照,探討SJAMP對細(xì)胞增殖的影響,為SJAMP抗腫瘤機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人肝癌細(xì)胞系Hep G2、人正常肝細(xì)胞張氏細(xì)胞系,購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑 SJAMP,購自中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院;高糖DMEM培養(yǎng)液、1640培養(yǎng)液及胎牛血清,均為美國Hyclone公司產(chǎn)品;四甲基偶氮唑鹽(MTT),Sigma公司產(chǎn)品;細(xì)胞周期與凋亡檢測試劑盒,碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品;兔抗人增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白抗體、SP-0023試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 恒溫CO2培養(yǎng)箱;Olympus顯微鏡;酶標(biāo)儀;流式細(xì)胞儀;超凈工作臺(tái)等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液,張氏細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的1640培養(yǎng)液,置于于37℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測SJAMP對細(xì)胞增殖的影響①常規(guī)培養(yǎng)Hep G2細(xì)胞和張氏細(xì)胞,取對數(shù)生長期的細(xì)胞,用2.5 g/L胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液,密度為1×1010/L。②將制備好的細(xì)胞懸液接種到96孔板,每個(gè)劑量組設(shè)5個(gè)平行孔,每孔200μL。置37℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜,待細(xì)胞貼壁。③棄去各孔培養(yǎng)液,換含有不同濃度SJAMP(0、0.5、2.0、8.0 mg/L)的培養(yǎng)液(內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清),分別培養(yǎng)12、24、48 h。④加入5 g/L的MTT溶液20μL,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,吸出各孔中的液體,每孔加入150μL的DMSO,快速振蕩1 min,待結(jié)晶產(chǎn)物充分溶解后,酶標(biāo)儀測490 nm波長處各孔吸光度(A)值,計(jì)算各組A值平均值及干預(yù)48 h時(shí)不同濃度SJAMP對Hep G2細(xì)胞抑制率。抑制率＝(未干預(yù)組A值－干預(yù)組A值)/未干預(yù)A值×100%。

1.2.3 碘化丙啶(PI)染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 ①取對數(shù)生長期細(xì)胞,2.5 g/L胰酶消化后制成細(xì)胞懸液,密度為1×107/L,接種于6孔板,每個(gè)劑量組設(shè)3個(gè)平行孔,置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。②吸出每孔培養(yǎng)液,換含有不同濃度SJAMP(0、0.5、2.0、8.0 mg/L)的培養(yǎng)液(內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。③2.5 g/L胰酶消化各孔細(xì)胞,以1 000 r/min離心3 min,PBS清洗2次,體積分?jǐn)?shù)0.70冰乙醇固定細(xì)胞4 h,冰浴PBS清洗細(xì)胞,以1 000 r/min離心3 min。④加PI染液,緩慢并充分重懸細(xì)胞,37℃避光溫浴30 min后,流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測PCNA的表達(dá) ①處理細(xì)胞爬片:載玻片經(jīng)酸、乙醇、多聚賴氨酸浸泡后,高壓滅菌。②消化細(xì)胞,制備細(xì)胞懸液,密度為5× 107/L。將高壓滅菌處理的載玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,玻片中央滴兩滴制備好的細(xì)胞懸液,培養(yǎng)皿置于37℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞完全貼壁后,每個(gè)培養(yǎng)皿中加入含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的培養(yǎng)液。12 h后,棄去各培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液,換含不同濃度SJAMP(0、0.5、2.0、8.0 mg/L)的培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清)。③24 h后,取出玻片,PBS沖洗3次,冰丙酮固定5 min。④向玻片上滴加體積分?jǐn)?shù)0.01的Trition-X100溶液,10 min后,PBS沖洗3次。⑤滴加體積分?jǐn)?shù)0.3的H2O2, 15 min后,PBS沖洗3次。⑥按照SP-0023試劑盒說明書進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,梯度乙醇脫水,中性樹膠封片。細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)以上高倍視野(600倍),每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,計(jì)算陽性細(xì)胞指數(shù)(%)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度SJAMP作用不同時(shí)間對Hep G2細(xì)胞和張氏細(xì)胞增殖的影響

對于Hep G2細(xì)胞,在干預(yù)時(shí)間相同條件下,隨著SJAMP干預(yù)濃度的升高,A值顯著降低(F＝68.430～596.680,q＝3.714～55.029,P＜0.05);干預(yù)劑量相同時(shí),24 h組A值與12 h組比較明顯升高,48 h組與24 h組比較升高不明顯。3個(gè)干預(yù)組作用48 h后的抑制率分別為11.13%、14.92%、18.63%。見表1。對于張氏細(xì)胞,相同時(shí)間、不同濃度SJAMP干預(yù)后,各組A值差異無顯著性(F＝0.462～0.629,P＞0.05);同一干預(yù)濃度條件下,隨著干預(yù)時(shí)間的延長,各組A值均明顯升高,差異有顯著性(F＝55.597～199.703,q＝6.357～29.275, P＜0.05)。見表2。

2.2 不同濃度SJAMP對細(xì)胞周期的影響

SJAMP干預(yù)使HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生變化,停留在G1期的細(xì)胞增多,S期和G2期的細(xì)胞減少,隨著SJAMP干預(yù)濃度的增加而變化,各組比較差異有顯著性(F＝4.403～18.791,q＝1.921～9.876,P＜0.05)。見表3。對于張氏細(xì)胞,不同濃度SJAMP作用后,細(xì)胞處于G1、S、G2期的比例未發(fā)生顯著改變(P＞0.05)。見表4。

2.3 不同濃度SJAMP對PCNA表達(dá)的影響

不論是否有SJAMP干預(yù),Hep G2細(xì)胞和張氏細(xì)胞中均有PCNA的表達(dá)。對于Hep G2細(xì)胞,隨著SJAMP濃度增加,PCNA表達(dá)降低,各組比較差異有顯著性(F＝2 688.640,q＝55.365～156.296, P＜0.05)。對于張氏細(xì)胞,不同濃度SJAMP干預(yù)后,其PCNA表達(dá)未出現(xiàn)明顯的變化(P＞0.05)。見表5。

表1 不同濃度SJAMP干預(yù)不同時(shí)間對HepG2細(xì)胞A值的影響(n＝5，±s)

SJAMP濃度_(ρ/mg·L－1)______ _______________________________________________作用時(shí)間(t/h) 12____________________________________ _24________ 48 0 1．631±0．015 1．777±0．026 1．807±0．018 0．5 1．580±0．013 1．615±0．012 1．606±0．007 2．0 1．507±0．008 1．526±0．016 1．537±0．005 ______8．0_______1．424±0．083__1．452±0_____________________．015 1．470±0．017

表2 不同濃度SJAMP干預(yù)不同時(shí)間對張氏細(xì)胞A值的影響(n＝5,±s)

SJAMP濃度_(ρ/mg·L－1)______ _______________________________________________作用時(shí)間(t/h) 12____________________________________ _24________ 48 0 1.682±0.044 1.779±0.045 1.868±0.007 0.5 1.676±0.018 1.778±0.031 1.867±0.008 2.0 1.670±0.033 1.793±0.017 1.872±0.007 ______8.0_______1.666±0.025__1.799±0_____________________.010 1.873±0.010

表3 不同濃度SJAMP對HepG2細(xì)胞周期的影響(n＝3,χ/%,±s)

SJAMP濃度(ρ/mg·L－1)G1期S期G2期0 53.121±1.470 28.491±0.430 18.388±1.248 0.5 55.980±1.086 26.381±0.365 17.639±0.774 2.0 59.047±0.887 23.572±1.130 17.381±0.524 _____8.0______67.816±4.660_22.572±1.815________________ 12.945±3.741

表4 不同濃度SJAMP對張氏細(xì)胞周期的影響(n＝3, χ/%,±s)___________________________________________

SJAMP濃度(ρ/mg·L－1)G1期S期G2期0 59.278±2.174 26.508±2.040 14.214±1.341 0.5 59.654±0.424 25.763±0.765 14.583±1.187 2.0 56.930±0.522 26.091±1.271 16.313±1.645 _____8.0______57.877±1.541_25.073±1.591________________ 17.023±0.620

表5 不同濃度SJAMP干預(yù)后Hep G2細(xì)胞和張氏細(xì)胞PCNA的表達(dá)(n＝3,±s)_____________________________

SJAMP濃度(ρ/mg·L－1)___Hep G2細(xì)胞_____________________ _張氏細(xì)胞0 0.591±0.006 0.585±0.003 0.5 0.496±0.005 0.578±0.005 2.0 0.385±0.003 0.584±0.007 ___________8.0________________________________________________ 0.272±0.004 0.581±0.005

3 討 論

近年來,隨著人們對多糖研究的不斷深入,多糖對腫瘤的抑制作用越來越受到重視。已有研究結(jié)果顯示,云芝多糖能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[6]。我們前期研究結(jié)果已證實(shí),SJAMP能夠抑制Hela細(xì)胞增殖[7],對DEN誘導(dǎo)的大鼠肝腫瘤也具有抑制作用[5]。本研究結(jié)果顯示,SJAMP作用于Hep G2細(xì)胞后對其增殖具有抑制作用,而且在一定范圍內(nèi)隨著劑量增大和作用時(shí)間延長,其抑制作用明顯增強(qiáng);SJAMP不影響正常肝細(xì)胞的增殖。

真核細(xì)胞的細(xì)胞周期分為間期和分裂期(M期),間期包括G1期、S期和G2期,細(xì)胞周期大部分時(shí)間處于間期,染色體復(fù)制發(fā)生在S期(DNA合成期),G2期之后進(jìn)入M期。G1期是惟一能接受外界信息刺激的時(shí)期,位于該時(shí)期的限制點(diǎn)是G1期～S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵時(shí)點(diǎn),該點(diǎn)的轉(zhuǎn)換決定了細(xì)胞繼續(xù)增殖還是停滯或死亡[8]。有研究表明,螺旋藻多糖可抑制Hela細(xì)胞和Hep G2細(xì)胞的增殖,使細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯[9]。我們前期研究結(jié)果也顯示, SJAMP可使Hela細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯[1,8]。本研究結(jié)果顯示,SJAMP能夠使Hep G2細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯,相同干預(yù)條件下,張氏細(xì)胞的細(xì)胞周期未發(fā)生顯著改變。表明SJAMP通過阻滯細(xì)胞周期,促使HepG2細(xì)胞停滯在G1期,抑制Hep G2細(xì)胞的增殖,發(fā)揮抗腫瘤的作用。

PCNA是DNA多聚酶δ的輔助蛋白,是真核細(xì)胞DNA合成過程所必需的一種核蛋白,其作用是調(diào)節(jié)DNA多聚酶的活性。已有研究表明,PCNA含量隨細(xì)胞周期的不同而變化,G1期開始增加,至S期達(dá)到高峰,G2、M期又明顯下降,G0期維持在最低水平,其變化過程與DNA的合成過程一致。目前,PCNA的表達(dá)被用來作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)、反映細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)的指標(biāo)[2,8]。我們的前期研究顯示,SJAMP能夠降低Hela細(xì)胞PCNA的表達(dá)[1,8]。本文結(jié)果表明,SJAMP干預(yù)后,Hep G2細(xì)胞中PCNA的表達(dá)隨著干預(yù)劑量的增加而降低,而張氏細(xì)胞PCNA的表達(dá)則無顯著改變。本實(shí)驗(yàn)中Hep G2細(xì)胞PCNA表達(dá)的變化與細(xì)胞周期的變化是一致的,表明SJAMP通過影響細(xì)胞周期而抑制Hep G2細(xì)胞的增殖。SJAMP抗腫瘤機(jī)制可能與SJAMP影響Hep G2細(xì)胞DNA合成有關(guān)。

綜上所述,SJAMP對Hep G2細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用,使細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯,對正常肝細(xì)胞的增殖無抑制作用,表明SJAMP具有一定的抗肝癌作用。本文結(jié)果為SJAMP在肝癌防治中的應(yīng)用提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù),其確切的機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

[1]牛娟娟,宋揚(yáng).海洋刺參多糖對宮頸癌細(xì)胞周期的影響及機(jī)制[J].齊魯醫(yī)學(xué)雜志,2010,25(5):386-388.

[2]牛娟娟,宋揚(yáng).刺參黏多糖的生物活性物質(zhì)作用研究進(jìn)展[J].華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,11(5):651-652.

[3]宋迪,吉愛國,梁浩,等.刺參生物活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].中國生化藥物雜志,2006,27(5):316-319.

[4]蘇秀榕,婁永江,常亞青,等.海參的營養(yǎng)成分及海參多糖的抗腫瘤活性的研究[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào),2003,25(2):181-182.

[5]梁囡囡,宋揚(yáng),金守杰.刺參酸性黏多糖對DEN誘導(dǎo)肝癌形成抑制作用[J].齊魯醫(yī)學(xué)雜志,2012,27(4):316-318.

[6]周永.多糖類抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué):衛(wèi)生學(xué)分冊,2001,28(3):129-132.

[7]王穎,于壯,宋揚(yáng).刺參酸性黏多糖對人宮頸癌Hela細(xì)胞caspase表達(dá)影響[J].齊魯醫(yī)學(xué)雜志,2008,23(3):191-194.

[8]張笑雪,于壯,宋揚(yáng).刺參黏多糖對Hela細(xì)胞PCNA表達(dá)及細(xì)胞周期的影響[J].山東醫(yī)藥,2008,48(46):19-21.

[9]于紅,張學(xué)成.螺旋藻多糖抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].高技術(shù)通訊,2003,13(7):83-86.

(本文編輯 黃建鄉(xiāng))

EFFECT OF STICHOPUS JAPONICUS ACID MUCOPOLYSACCHARIDE ON PROLIFERATION OF LIVER CANCER CELL HepG2

JIN Yan,SONG Yang,CHEN Chen (Department of Nutrition,Qingdao University Medical College,Qingdao 266021,China)

Objective To study the effect of stichopus japonicus acid mucopolysaccharide(SJAMP)on proliferation of human liver cancer cell HepG2.MethodsHepG2 cells were cultured in vitro.MTT assay was used to observe the effect of SJAMP on proliferation of HepG2 cells.The cell cycle was measured using flow cytometry(FCM).The expression of PCNA was tested by immunocytochemistry.Normal liver cells(Zhang’s liver cells)were served as the control.ResultsSJAMP could inhibit the proliferation of HepG2 cells,its depressant effect reinforced along with the increase of intervention dose(0,0.5,2.0, 8.0 mg/L)and extension of intervention time(12,24,48 h)(F＝68.430－596.680;q＝3.714－55.029;P＜0.05);Different concentrations of SJAMP did not show apparent inhibition on proliferation of Zhang’s cells(P＜0.05).The results of cell cycle detection indicated that with the increase of SJAMP dose,the Hep G2 cells that trapped in G1 phase increased(F＝4.483－18.791;q＝1.921－9.876;P＜0.05);as for Zhang’s cells,no changes of cell cycle were noted after interfered with SJAMP(P＞0.05)Immunocytochemical technique indicated that after SJAMPintervention,the expression of PCNA in Hep G2 cells declined,the expression decreased as the dose of SJAMP increased(F＝2 688.640,q＝55.365－156.296,P＜0.05),no notable effect on the expression of Zhang’s cells was observed(P＞0.05).ConclusionSJAMP plays an anti-tumor action through inhibiting the proliferation,blocking cell cycle and decreasing expression of PCNA of Hep G2 cells.

polysaccharides;stichopus;liver neoplasms;cell proliferation

R151.3

A

1008-0341(2013)04-0299-04

10.11712/qlyx201304006

2013-02-03;

2013-05-24

國家自然基金資助項(xiàng)目(002-002395)

金巖(1986-),女,在讀碩士研究生。

宋揚(yáng)(1968-),男,博士,教授,碩士生導(dǎo)師。