陳沉,金巖,宋揚(yáng)

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)研究所,山東青島 266021)

·腫瘤學(xué)研究·

刺參酸性黏多糖對(duì)人肝癌Hep G2細(xì)胞線粒體膜電位及鈣離子濃度的影響

陳沉,金巖,宋揚(yáng)

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)研究所,山東青島 266021)

目的觀察刺參酸性黏多糖(SJAMP)體外誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞Hep G2凋亡的情況,探討SJAMP對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體凋亡途徑相關(guān)膜電位作用機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2,用不同濃度的SJAMP (0.25、1.00、4.00 mg/L)對(duì)其進(jìn)行干預(yù),應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位改變,Fura-2熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞鈣離子濃度改變。在相同條件下干預(yù)人正常肝細(xì)胞(張氏細(xì)胞)以觀察其對(duì)正常細(xì)胞的影響。結(jié)果隨著SJAMP劑量的增加,Hep G2細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及線粒體膜電位均降低,各干預(yù)組與空白對(duì)照組比較、各干預(yù)組間比較差異均有顯著性(F＝183.36、264.24,q＝3.26～35.67,P＜0.05);而張氏細(xì)胞各干預(yù)組鈣離子濃度及線粒體膜電位(除0.25 mg/L SJAMP作用組線粒體膜電位高于其他組外)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論SJAMP可能通過降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和細(xì)胞線粒體膜電位,誘導(dǎo)線粒體通透性的改變,啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑。

肝腫瘤;HepG2細(xì)胞;刺參屬(動(dòng)物);多糖;細(xì)胞凋亡

原發(fā)性肝癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,具有發(fā)病率高、發(fā)現(xiàn)晚、惡化率高等特征,嚴(yán)重威脅人類生命健康。由于現(xiàn)有抗肝腫瘤化學(xué)藥物副作用較大,越來(lái)越多的研究人員將抗腫瘤研究轉(zhuǎn)向自然環(huán)境中高效低副作用的多糖類物質(zhì)[1]。刺參酸性黏多糖(SJAMP)是刺參體壁真皮結(jié)締組織中的一種生物活性結(jié)締組織多糖,眾多研究顯示,其具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及促細(xì)胞生長(zhǎng)等多種活性作用[2-4]。線粒體膜電位的改變是細(xì)胞線粒體凋亡途徑的重要起始階段,由于線粒體膜電位改變引起線粒體通透性變化,進(jìn)一步釋放出細(xì)胞色素C等促凋亡因子,促使細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)SJAMP對(duì)Hep G2細(xì)胞線粒體膜電位相關(guān)指標(biāo)的影響,為進(jìn)一步探討SJAMP促細(xì)胞凋亡作用提供初步理論依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞及人正常肝組織細(xì)胞(人張氏肝細(xì)胞),由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞研究所提供,使用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM、1640培養(yǎng)液,在37℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2孵箱中培養(yǎng)[5]。

1.2 熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep G2細(xì)胞以及人張氏肝細(xì)胞,以1×109/L的密度接種于6孔培養(yǎng)板中,細(xì)胞貼壁后,棄上清,各組分別加入終濃度為0.25、1.00、4.00 mg/L的SJAMP,以不加SJAMP者作為空白對(duì)照組,孵育24 h后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)鈣離子檢測(cè)。將含有2μmol/L Fura-2 AM的適當(dāng)溶液和細(xì)胞一起在37℃條件下孵育30 min,完成熒光探針的裝載。PBS洗滌2次,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作,綠色熒光代表被結(jié)合的鈣離子。用奧林巴斯公司提供熒光顯微鏡觀察,激發(fā)波長(zhǎng)340 nm,發(fā)射波長(zhǎng)510 nm,采用Imagepro-plus軟件進(jìn)行熒光分析,以Integral Optical Density(IOD)值表示鈣離子濃度。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,以1×109/L的密度接種于6孔培養(yǎng)板中,細(xì)胞貼壁后,棄上清,各組分別加入濃度為0.25、1.00、4.00 mg/L的SJAMP,孵育24 h后用2.5 g/L胰酶收集所有細(xì)胞,再將細(xì)胞吹打均勻,制成單細(xì)胞懸液,用PBS調(diào)整細(xì)胞密度至1×1012/L,加入染色劑JC-1(終濃度為5 mg/L), 37℃避光20 min,棄上清,PBS洗2次,用PBS溶液重懸沉淀,流式細(xì)胞儀檢測(cè)JC-1單體(激發(fā)波長(zhǎng)490 nm,發(fā)射波長(zhǎng)530 nm)和JC-1聚合物(激發(fā)波長(zhǎng)525 nm,發(fā)射波長(zhǎng)590 nm),用熒光強(qiáng)度值表示線粒體膜電位[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度SJAMP對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度影響

SJAMP作用與非作用的HepG2細(xì)胞內(nèi)都有鈣離子的存在,與Fura-2熒光染料結(jié)合后顯藍(lán)綠色熒光。隨著SJAMP濃度的增加,HepG2細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度逐漸下降,各劑量組與空白對(duì)照組、各劑量組之間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝183.36,q＝6.44～27.01,P＜0.05);而人張氏肝細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度沒有明顯改變(P＞0.05)。見表1。

2.2 不同濃度SJAMP對(duì)線粒體膜電位的影響

隨著SJAMP濃度的增加,Hep G2細(xì)胞線粒體膜電位逐漸下降,各劑量組與空白對(duì)照組、各劑量組之間比較,差異均有顯著性(F＝264.24,q＝3.26～35.67,P＜0.05);而人張氏肝細(xì)胞線粒體膜電位除低劑量組(0.25 mg/L)高于其他組外,其他各組比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。見圖1、2,表2。

表1 不同濃度SJAMP對(duì)HepG2及人張氏肝細(xì)胞鈣離子濃度的影響(n＝3,IOD±s)

SJAMP濃度(ρ/mg·L－1)___Hep G2細(xì)胞_____________________人張氏肝細(xì)胞0 115.33±5.13 62.35±2.31 0.25 81.67±3.76 79.42±3.01 1.00 64.33±3.51 75.22±2.08 ____________4.00_______________________________________________ 44.00±2.64 72.33±3.51

表2 不同濃度SJAMP對(duì)HepG2細(xì)胞及人張氏肝細(xì)胞線粒體膜電位的影響(n＝3±s)_______________________

SJAMP濃度(ρ/mg·L－1)___Hep G2細(xì)胞_____________________人張氏肝細(xì)胞0 62.82±4.64 19.92±0.62 0.25 22.11±2.13 21.36±0.84 1.00 12.63±1.43 19.48±0.18 ___________4.00_____________________________________________ 7.89±0.55 19.75±0.33

3 討 論

凋亡或稱程序性細(xì)胞死亡,是一種受基因調(diào)節(jié)的自主控制過程,在生物個(gè)體發(fā)育和生存中起著非常重要的作用。已有研究表明,線粒體是細(xì)胞凋亡調(diào)控的活動(dòng)中心,Ca2＋-cytc-caspase-3信號(hào)介導(dǎo)的線粒體凋亡通路是公認(rèn)的經(jīng)典凋亡途徑[8]。線粒體外膜通透性增加及膜間凋亡分子釋放,是決定凋亡起始的關(guān)鍵步驟[9]。細(xì)胞鈣離子濃度降低引起跨膜電位下降,將會(huì)引起線粒體膜通透性改變,導(dǎo)致促凋亡物質(zhì)的釋放及Caspase家族激活,促使細(xì)胞凋亡。多數(shù)細(xì)胞凋亡時(shí)跨膜電位均會(huì)下降,這種改變發(fā)生于細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變之前,提示跨膜電位的改變?yōu)榧?xì)胞凋亡過程中的早期階段[10]。

SJAMP具有抗腫瘤活性,能夠抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,但是其抗腫瘤的分子機(jī)制尚處研究階段。我們前期研究顯示,SJAMP作用于Hela細(xì)胞后,各干預(yù)組的細(xì)胞周期蛋白PCNA表達(dá)量均下調(diào),且隨著SJAMP濃度的增大及作用時(shí)間的延長(zhǎng),各干預(yù)組中caspase-3及caspase-9的表達(dá)均有增加趨勢(shì),說(shuō)明SJAMP能通過抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡兩種方式抗腫瘤[11-12]。

本研究結(jié)果顯示,隨著SJAMP劑量的增加,肝癌細(xì)胞株Hep G2細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度及線粒體膜電位逐漸降低,而人張氏肝細(xì)胞株并沒有明顯改變,提示SJAMP作用于Hep G2細(xì)胞后,可能會(huì)引起細(xì)胞鈣離子濃度的降低及線粒體膜電位的下降,使線粒體內(nèi)外通透性改變,從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑。本文結(jié)果與張延坤等[13]和安超等[14]研究結(jié)果相似。

人張氏肝細(xì)胞是人永生化的肝細(xì)胞株,具有人類正常肝細(xì)胞的各種特征,本研究使用張氏肝細(xì)胞作為正常肝細(xì)胞對(duì)照組,以探討SJAMP對(duì)正常肝細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示,在與Hep G2細(xì)胞相同劑量SJAMP作用下,人張氏肝細(xì)胞各干預(yù)組線粒體膜電位并沒有表現(xiàn)出類似于HepG2細(xì)胞干預(yù)組的明顯改變,除低劑量組(0.25 mg/L)線粒體膜電位高于其他組外,其他各組比較差異均無(wú)顯著性,說(shuō)明SJAMP對(duì)人張氏肝細(xì)胞的線粒體膜電位及細(xì)胞鈣離子濃度無(wú)影響。對(duì)于低劑量(0.25 mg/L)SJAMP作用組線粒體膜電位高于其他組,其原因可能為:①線粒體膜電位改變時(shí),電子傳遞鏈會(huì)漏出少量的電子,這類電子能直接和氧形成超氧自由基進(jìn)一步衍生為活性氧(ROS),而ROS能夠引發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激,引起細(xì)胞損傷,導(dǎo)致線粒體膜電位的紊亂[15];②線粒體膜電位的改變迅速而敏感,人張氏肝細(xì)胞對(duì)于SJAMP的敏感濃度范圍可能過小。陳尉華等[15]的研究結(jié)果顯示,藥物濃度過低對(duì)人張氏肝細(xì)胞的干預(yù)作用不明顯,而過高會(huì)漸漸出現(xiàn)抑制作用。故本研究低劑量(0.25 mg/L)SJAMP干預(yù)組人張氏肝細(xì)胞線粒體膜電位的變化,可能是由于誘發(fā)了細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng),或其濃度恰好處于人張氏肝細(xì)胞的敏感濃度范圍之內(nèi)而產(chǎn)生的,其發(fā)生的具體原因亟待進(jìn)一步研究。

總之,SJAMP能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低及線粒體膜電位下降,說(shuō)明其具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞線粒體起始凋亡途徑的作用。

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(本文編輯 黃建鄉(xiāng))

EFFECTOFJAPONICUSACIDMUCOPOLYSACCHARIDEONMITOCHONDRIALMEMBRANEPOTENTIALANDCALCIUM IONCONCENTRATIONINHUMANLIVERCANCERHepG2CELLS

CHEN Chen,JIN Yan,SONG Yang (Department of Nutrition,Qingdao University Medical College,Qingdao 266021,China)

ObjectiveTo study the HepG2 cell apoptosis induced by Stichopus japonicus acidic mucopolysaccharide (SJAMP)in vitro,and explore the mechanism of changes of its correlated mitochondrial membrane potential.MethodsHepG2 cells cultured in vitro were exposed to different concentrations of SJAMP(0.25,1.00,4.00 mg/L).Flow cytometry was used to detect the changes of mitochondrial membrane potential,and a fluorescence microscope to measure the calcium ion concentration in the cells.Chang’s liver cells were interfered under the same conditions to observe their influence on normal cells.ResultsWith the increasing of SJAMP dose,the intracellular calcium ion concentration and membrane potential decreased,a comparison between each intervention group and blank control group,as well as between each intervention group,the differences being significant(F＝183.36,264.24;q＝3.26－35.67;P＜0.05).In Chang’s liver cells,the differences of calcium ion concentrations and membrane potential between each intervention group were not significant－except 0.25 mg/L SJAMP action group(P＞0.05).ConclusionSJAMP is likely through decreasing intracellular calcium ion concentration and cell mitochondrial membrane potential,inducing changes of permeability of mitochondrial membrane and initiating the path of apoptosis.

liver neoplasms;HepG2 cells;stichopus;mucopolysaccharide;cell apoptosis

R151.3

A

1008-0341(2013)04-0283-04

10.11712/qlyx201304001

2013-01-13;

2013-05-21

國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目(002-002395)

陳沉(1987-),男,碩士研究生。

宋揚(yáng)(1968-),男,博士,教授,碩士生導(dǎo)師。