于嘯,張婷,楊晨曦,王言奎

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,山東青島 266003)

5-Aza-dc對(duì)宮頸癌細(xì)胞系FAM9C基因表達(dá)及甲基化影響

于嘯,張婷,楊晨曦,王言奎

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,山東青島 266003)

目的探討甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2’脫氧胞苷(5-Aza-dc)對(duì)宮頸癌細(xì)胞系抑癌基因FAM9C表達(dá)及甲基化狀態(tài)的影響。方法常規(guī)培養(yǎng)高危型人乳頭瘤病毒(HPV)陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞系HeLa、Caski和HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3、C-33A,分別用5、10、15μmol/L的5-Aza-dc作用3、5、7 d,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測(cè)FAM9C基因表達(dá),甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測(cè)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。結(jié)果未經(jīng)5-Aza-dc處理的HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞系FAM9C基因呈低表達(dá),基因啟動(dòng)子區(qū)表現(xiàn)為完全甲基化狀態(tài);未經(jīng)5-Aza-dc處理的HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系FAM9C基因表達(dá)水平較高,基因啟動(dòng)子區(qū)呈不完全甲基化和非甲基化狀態(tài)。10或15μmol/L的5-Aza-dc作用5 d時(shí),HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞系HeLa、Caski的FAM9C基因表達(dá)顯著上調(diào),基因啟動(dòng)子區(qū)由完全甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌耆谆头羌谆癄顟B(tài);HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3、C-33A應(yīng)用5-Aza-dc處理前后FAM9C基因表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)無(wú)明顯變化。結(jié)論HPV誘導(dǎo)異常甲基化可能是宮頸癌細(xì)胞系FAM9C基因表達(dá)降低甚至沉默的主要原因;甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-dc能逆轉(zhuǎn)FAM9C基因甲基化狀態(tài),使該基因重新表達(dá)。

宮頸腫瘤;人乳頭瘤病毒;DNA甲基化;5-氮雜-2’脫氧胞苷

DNA甲基化是目前表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn),基因突變、染色體物質(zhì)缺失以及基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化被認(rèn)為是抑癌基因功能失活的重要機(jī)制。高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染被認(rèn)為是導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)及宮頸癌發(fā)生的重要原因[1]。HPV通過(guò)誘導(dǎo)抑癌基因異常甲基化而導(dǎo)致其功能失活可能是HPV致癌機(jī)制之一[2-3]。5-氮雜-2’脫氧胞苷(5-Aza-dc)是一種類核苷甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,可與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共價(jià)結(jié)合抑制其活性,逆轉(zhuǎn)基因甲基化狀態(tài),使因甲基化而沉默基因重新表達(dá)。本課題組前期研究自宮頸癌細(xì)胞系篩選出可能因HPV誘導(dǎo)高甲基化而沉默的抑癌基因FAM9C,該基因編碼的蛋白與細(xì)胞核定位信號(hào)相關(guān),其表達(dá)缺失與染色體異常有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)探討了5-Aza-dc對(duì)FAM9C基因表達(dá)以及甲基化狀態(tài)的影響,旨在為5-Aza-dc有效逆轉(zhuǎn)宮頸癌細(xì)胞系基因甲基化狀態(tài)尋找最佳作用濃度和時(shí)間提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

HPV18陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞系HeLa及HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3,由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存;HPV16陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞系Caski,購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所;HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系C-33A,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。DMEM培養(yǎng)液、TRIzol和胎牛血清均購(gòu)自GIBCO公司;D-Hanks粉劑購(gòu)自Hyclone公司;5-Aza-dc、氫醌和亞硫酸氫鈉購(gòu)自Sigma公司。RNeasy Mini試劑盒、Quantifast SYBR Green PCR試劑盒和QIAEXⅡDNA回收試劑盒均購(gòu)自QIAGEN公司;Revert Aid第一鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)自Fermentas公司;HotStart TaqDNA聚合酶等PCR相關(guān)試劑購(gòu)自Ta KaRa公司;飽和酚、氯仿及無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)試劑;引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、100 k U/L青霉素和200 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,于37℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HeLa、Caski、HT-3和C-33A細(xì)胞系。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述4種細(xì)胞接種至75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶,細(xì)胞貼壁后分別加入5、10、15μmol/L的5-Aza-dc,分別作用3、5、7 d,每24 h換含相同濃度藥物的培養(yǎng)液1次。以未經(jīng)5-Aza-dc處理的細(xì)胞系作為對(duì)照組。5-Aza-dc作用結(jié)束后胰蛋白酶消化單層細(xì)胞,D-Hanks液洗細(xì)胞2次,離心收集細(xì)胞沉淀。

1.3 核酸提取及DNA亞硫酸氫鹽修飾

酚-氯仿-異戊醇法常規(guī)提取細(xì)胞DNA,超純水溶解,紫外線分光光度法測(cè)定各樣品DNA濃度。取5μg細(xì)胞DNA,加3.3μL新鮮配制的3 mol/L NaOH溶液混勻變性,37℃水浴15 min,加333μL新鮮配制的亞硫酸氫鹽溶液(2.4 mol/L亞硫酸氫鈉,3 mol/L NaOH和10 mmol/L氫醌的混合液), 55℃避光孵育4 h進(jìn)行DNA亞硫酸氫鹽修飾。采用DNA回收試劑盒對(duì)修飾后的DNA進(jìn)行脫鹽純化處理。將處理后DNA溶于50μL TE溶液中,室溫靜置5 min,加入3 mol/L NaOH 5.56μL,37℃水浴15 min,使其脫磺化基團(tuán)。再加入9 mol/L NH4OAC(p H 7.0)27.78μL,3 mol/L NaOAC (p H 5.2)50μL,采用DNA回收試劑盒再次回收純化,將純化后的DNA溶解于100μL TE溶液中,置－20℃保存,用于甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)。

1.4 FAM9C基因表達(dá)檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法。使用TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA,RNeasy Mini試劑盒純化,參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為PCR模板,－20℃保存,1周內(nèi)使用。采用qRT-PCR方法分別檢測(cè)He La、Caski、HT-3和C-33A細(xì)胞系在不同5-Aza-dc濃度和時(shí)間作用下FAM9C基因表達(dá)水平,以未經(jīng)5-Aza-dc處理的細(xì)胞系為對(duì)照組,并設(shè)立空白對(duì)照。應(yīng)用Prime premier 5軟件設(shè)計(jì)特異性引物,FAM9C基因上游引物序列為:5′-CAAGGACCAGTTGGAGGTTC-3′,下游引物序列為:5′-TACTGGATCCTTTCCTGCAA-3′,應(yīng)用羅氏Light Cycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析。qRT-PCR反應(yīng)體系為20μL,包括:2×Quantifast SYBR Green PCR混合液10μL,上、下游引物0.5μmol/L,無(wú)RNase水6μL,模板cDNA 2μL。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性15 min;94℃變性15 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共循環(huán)40次;每次循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熒光檢測(cè);同時(shí)擴(kuò)增GAPDH作為內(nèi)參照基因。擴(kuò)增結(jié)束后, 95℃1 min,55℃30 s后逐步升溫至95℃進(jìn)行融解曲線分析,確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。測(cè)定各樣本反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct),每個(gè)樣品均重復(fù)檢測(cè)3次,取其Ct均值。采用2－△△Ct相對(duì)定量法[4]分析目的基因在各組細(xì)胞中表達(dá)差異,其中△Ct＝目的基因Ct－內(nèi)參照基因Ct,△△Ct＝處理組△Ct－對(duì)照組△Ct。

1.5 FAM9C基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)檢測(cè)

采用MSP方法,檢測(cè)He La、Caski、HT-3和C-33A細(xì)胞系在5-Aza-dc不同濃度和時(shí)間作用下FAM9C基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài),以未經(jīng)5-Azadc處理的細(xì)胞系為對(duì)照組,并設(shè)立陰性對(duì)照。應(yīng)用Methprimer軟件設(shè)計(jì)甲基化特異性引物(M),上游引物序列為:5′-TTTATGTCGTTCGTTATTTGTATGC-3′,下游引物序列為:5′-AACCTAAATCCTCTATTCTCACGAA-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)103 bp;非甲基化特異性引物(U),上游引物序列為:5′-ATGTTGTTTGTTATTTGTATGTGT-3′,下游引物序列為:5′-AACCTAAATCCTCTATTCTCACAAA-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)100 bp。MSP反應(yīng)體系25μL,包括:亞硫酸氫鹽修飾的DNA模板2μL,熱啟動(dòng)DNA聚合酶1 U,1.5 mmol/L MgCl2,0.2 nmol/L d NTP和0.6 mmol/L引物。MSP反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,共循環(huán)35次;最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳,紫外線凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,FAM9C基因各時(shí)間、濃度組間表達(dá)差異比較采用析因設(shè)計(jì)方差分析,組間比較采用LSD法,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 5-Aza-dc不同濃度、不同作用時(shí)間對(duì)宮頸癌細(xì)胞系FAM9C基因表達(dá)影響

融解曲線分析顯示,qRT-PCR基因擴(kuò)增產(chǎn)物呈單峰,為特異性擴(kuò)增,空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增。未經(jīng)5-Azadc處理的對(duì)照組HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞系He La和Caski細(xì)胞系FAM9C基因均呈低表達(dá);不同濃度5-Aza-dc作用不同時(shí)間后其表達(dá)均有不同程度的上調(diào),其中10μmol/L 5-Aza-dc作用5 d組He La細(xì)胞系FAM9C基因表達(dá)上調(diào)最為明顯,差異有顯著性(F＝4.044,P＜0.05);15μmol/L 5-Aza-dc作用5 d時(shí)Caski細(xì)胞系FAM9C基因表達(dá)上調(diào)最為顯著,差異有顯著意義(F＝5.486、4.022,P＜0.05)。HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3和C-33A細(xì)胞5-Aza-dc作用前后,FAM9C基因表達(dá)差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。見表1。

2.2 FAM9C基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)

未經(jīng)5-Aza-dc處理的對(duì)照組He La和Caski細(xì)胞系FAM9C基因只有甲基化特異性引物(M)擴(kuò)增出條帶,其基因啟動(dòng)子區(qū)表現(xiàn)為完全甲基化狀態(tài); HPV陰性宮頸癌細(xì)胞HT-3甲基化特異性引物和非甲基化特異性引物均擴(kuò)增出條帶(M＋U),基因啟動(dòng)子區(qū)為不完全甲基化狀態(tài);C-33A細(xì)胞系僅非甲基化特異性引物擴(kuò)增出條帶(U),基因啟動(dòng)子區(qū)為非甲基化狀態(tài)。5-Aza-dc處理后,HeLa和Caski細(xì)胞系FAM9C基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度降低,由完全甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌耆谆头羌谆癄顟B(tài); HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系5-Aza-dc作用前后甲基化狀態(tài)無(wú)明顯改變(圖1)。

3 討 論

腫瘤發(fā)生多伴隨抑癌基因的功能減弱或沉默,抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化被認(rèn)為是除突變和缺失以外抑癌基因功能失活的關(guān)鍵機(jī)制,與基因表達(dá)沉默有一定相關(guān)性[5-7]。約90%的宮頸癌組織中可以檢測(cè)到HPV存在,而HPV感染通過(guò)表觀遺傳學(xué)機(jī)制誘導(dǎo)宿主細(xì)胞抑癌基因高甲基化,導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)沉默,可能是HPV促進(jìn)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一[8-9]。以5-Aza-dc為代表的類核苷甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,通過(guò)與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共價(jià)結(jié)合抑制其活性,降低基因甲基化水平,已廣泛應(yīng)用于逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的異常甲基化,誘導(dǎo)由于甲基化而沉默的腫瘤抑制基因重新表達(dá),抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),從而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)。5-Aza-dc這種逆轉(zhuǎn)基因甲基化水平的作用,為研究甲基化對(duì)基因表達(dá)的影響提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

表1 不同濃度5-Aza-dc作用不同時(shí)間宮頸癌細(xì)胞系FAM9C基因相對(duì)表達(dá)量比較±s)

時(shí)間(t/d)濃度(c/ μmol·L－1)HeLa Caski HT-3 C-33A 3 5 1.738±0.405 1.384±0.283 1.131±0.051 1.080±0.085 10 2.451±0.392 1.455±0.062 0.853±0.175 0.867±0.068 15 2.368±0.437 1.734±0.203 0.883±0.030 0.917±0.075 5 5 1.985±0.215 1.562±0.205 0.859±0.062 1.128±0.112 10 2.186±0.532 1.801±0.152 1.041±0.038 1.636±0.263 15 1.746±0.418 1.992±0.246 0.630±0.211 0.998±0.096 7 5 1.304±0.190 1.263±0.128 0.676±0.141 1.786±0.112 10 2.345±0.361 1.451±0.201 0.939±0.049 0.663±0.091 _________15___1.981±0.493 1.651±0.248 0.769±0.07____________ 4 1.039±0.085

我們前期研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)自宮頸癌細(xì)胞系篩選出可能由HPV誘導(dǎo)高甲基化而沉默的抑癌基因FAM9C,該基因位于Xp22.2,其編碼蛋白與細(xì)胞核定位信號(hào)相關(guān)。有研究認(rèn)為,FAM9C表達(dá)缺失與染色體異常有關(guān),但具體功能尚未明確[10]。本研究通過(guò)應(yīng)用不同濃度5-Aza-dc作用不同時(shí)間處理HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞系He La、Caski和HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3、C-33A,探討5-Aza-dc作用對(duì)FAM9C基因表達(dá)以及甲基化狀態(tài)的影響。結(jié)果顯示,未經(jīng)5-Aza-dc處理的HPV陽(yáng)性He La和Caski宮頸癌細(xì)胞系FAM9C基因均呈低表達(dá),不同濃度5-Aza-dc作用不同時(shí)間后該基因均有不同程度的表達(dá)上調(diào);5-Aza-dc處理He La和Caski細(xì)胞系可降低FAM9C基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài),變?yōu)椴煌耆谆癄顟B(tài),該基因表達(dá)與啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系;5-Aza-dc作用HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3和C-33A細(xì)胞前后,FAM9C基因表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)均無(wú)明顯變化,提示FAM9C基因的沉默可能與HPV作用有關(guān),HPV可能誘導(dǎo)該基因的高甲基化。5-Aza-dc作用可逆轉(zhuǎn)HPV陽(yáng)性He La和Caski宮頸癌細(xì)胞系FAM9C基因的甲基化狀態(tài),誘導(dǎo)該基因的表達(dá)水平升高,其中以10、15μmol/L濃度組作用5 d效果較為明顯。

綜上所述,5-Aza-dc可逆轉(zhuǎn)基因甲基化狀態(tài),使基因重新表達(dá),不同濃度5-Aza-dc作用不同時(shí)間后對(duì)基因表達(dá)影響不同。通過(guò)對(duì)5-Aza-dc影響宮頸癌細(xì)胞FAM9C基因表達(dá)及甲基化狀態(tài)的分析,可為5-Aza-dc處理宮頸癌細(xì)胞系逆轉(zhuǎn)基因甲基化狀態(tài)尋找最佳作用濃度和作用時(shí)間提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。對(duì)HPV相關(guān)腫瘤表觀遺傳學(xué)的深入研究有助于闡明HPV在宿主細(xì)胞基因甲基化發(fā)生中的作用機(jī)制。

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(本文編輯 黃建鄉(xiāng))

EFFECT OF 5-Aza-dc-2’-DEOXYCYTIDINE ON THE EXPRESSION AND METHYLATION OF FAM9C GENE IN CERVICAL CANCER CELL LINES

YU Xiao,ZHANG Ting,YANG Chenxi,WANG Yankui (Department of Obstetrics and Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China)

ObjectiveTo investigate the effect of 5-Aza-dc-2’-deoxycytidine(5-Aza-dc)on the expression and methylation of FAM9C gene.MethodsHPV-positive cervical cancer cells(He La and Caski)and HPV-negative cervical cancer cells(C-33A and HT-3)were cultured with different doses of 5-Aza-dc(5,10 and 15μmol/L)for different time,3 days,5 days and 7 days,respectively.Gene expression was detected by using fluorescent quantitative real-time PCR and methylation status of gene promoters by methylation-specific PCR.ResultsIn HPV-positive cervical cancer cell line that not yet treated with 5-Aza-dc, FAM9C gene showed low expression and its promoters were completely methylated;in HPV-negative that not yet treated with 5-Aza-dc,the expression of FAM9C was higher,and incompletely methylated or non-methylated promoters were observed.The expression of FAM9C gene in HPV-positive cervical cancer cells significantly increased with 10 or 15μmol/L 5-Aza-dc treatment for 5 days.Gene promoters reversed to incompletely methylated or non-methylated from complete methylation.The expression and methylation status of FAM9C gene were not significantly changed in HPV-negative cervical cancer cells－before and after treatment with HT-3,C-33A and 5-Aza-dc.ConclusionHPV-induced abnormal methylation is probably a main cause of decreased expression or even silent of FAM9C gene;methyltransferase inhibitor 5-Aza-dc can invert the methylation status of the gene and make it to re-express.

uterine cervical neoplasms;human papillomavirus;DNA methylation;5-Aza-dc-2’-deoxycytidine

R711

A

1008-0341(2013)04-0292-04

10.11712/qlyx201304004

2013-02-26;

2013-06-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81172480)

于嘯(1986-),女,在讀碩士研究生。

王言奎(1960-),男,碩士,教授,博士生導(dǎo)師。