蘇濤綜述，劉丕審校

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，南昌 330006)

自嗜是廣泛存在于真核細胞中的基本生命現(xiàn)象復(fù)制，它是依賴于溶酶體實現(xiàn)大分子及細胞器降解途徑。在大多數(shù)細胞中，自嗜在細胞內(nèi)起“清道夫”作用，是細胞內(nèi)細胞器和其它結(jié)構(gòu)自然減員和更新的正常途徑。在細胞受到各種理化因素傷害時，它扮演著保護角色，使細胞更好的適應(yīng)外界環(huán)境的變化。當自嗜損傷，可以引起一系列病理反應(yīng)，與一些疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前研究表明自嗜功能異常在急性胰腺炎發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的作用。本文簡要綜述自嗜在急性胰腺炎中的作用。

1 自嗜溶酶體途徑特點

1.1 自嗜的分類 哺乳動物細胞自嗜(autophagy)可分為 3種主要方式[1]：大自噬(Macroautophagy)、小自噬 (Microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自嗜(chaperone-mediated autophagy，CMA)，其中大自嗜是最主要的方式，在大自嗜中由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的膜包繞待降解物，形成自嗜體后與溶酶體融合并降解其內(nèi)容物；然而在小自嗜中，是溶酶體膜直接內(nèi)陷包裹，并在溶酶體內(nèi)降解包裹物，并沒有形成自嗜小體。分子伴侶介導(dǎo)自嗜則是胞漿內(nèi)的蛋白進入溶酶體需要通過分子伴侶 (heat shock cognate protein of 70kDa,HSC70)與底物結(jié)合后再與溶酶體膜上的受體 (lysosome associated membrane protein type2,LAMP-2)結(jié)合。目前,對自噬的研究主要集中在大自噬,常被人們狹義定義為細胞自嗜。雖然3種細胞自噬有所不同,但它們功能上在細胞應(yīng)對外界應(yīng)激和清除受損物質(zhì)過程中起到共同作用。另外，分泌自嗜是溶酶體直接融合分泌顆粒，雖然自嗜與分泌自嗜都包括內(nèi)源性的溶酶體酶，仍然沒有確定分泌自噬和自噬是同一機制的形態(tài)學(xué)證據(jù)。

1.2 自嗜形成過程 自噬通常包括以下步驟[2]：在此過程中，很多Atg(autophagy related genes)蛋白定位到啟始序列室區(qū) (initial sequesteringcompartment)，這一結(jié)構(gòu)在酵母菌被稱之為自噬前體結(jié)構(gòu)(pre-autophagosomal structure，PAS)。 首先，細胞在饑餓、缺氧、損傷等刺激下，并在自嗜起始信號的調(diào)控下，形成雙層膜結(jié)構(gòu)，稱為吞噬泡；然后，膜逐漸延伸包繞細胞成份形成自噬體；最后，自噬體通過細胞骨架微管系統(tǒng)運至溶酶體，與之融合形成自噬溶酶體并降解包含物。這個過程被基因Atg控制，同樣也受磷脂酰肌醇三磷酸激酶(PI3K)調(diào)控。自嗜形成的任何一個步驟受影響都引起其整個過程的功能失調(diào)。自嗜潮被定義為自嗜的整個動態(tài)過程。

因此，我們不僅要檢測自嗜體的形成，還要動態(tài)的觀察自嗜的降解過程是否順利，目前對自嗜的檢測普遍采用電鏡、免疫熒光、蛋白印跡等方法檢測自嗜體積及其標志蛋白及其降解底物的檢測，另外通過藥物或基因干預(yù)技術(shù)來調(diào)控自嗜以觀察其在體內(nèi)體外模型中的作用[3]。

2 自嗜與胰腺炎

2.1 自嗜在胰腺中的生理作用 Mizushima等[4]在GFP-LC3老鼠中，通過GFP-LC3熒光斑的表達的檢測，發(fā)現(xiàn)外分泌胰腺組織中基礎(chǔ)自嗜的水平高于肝臟、腎、心臟，同樣在24h饑餓誘導(dǎo)后自嗜體會增加數(shù)量，且胰腺組織的自嗜水平也高于其他器官。一種可能的原因是胰腺組織中需要合成更多的蛋白，它可能更需要清除過量和有缺陷的蛋白。確實外分泌胰腺組織的功能是分泌消化酶，它們大多以不活躍的酶原形式儲存在酶原顆粒中，一般它們分泌到腸道中才有活性[5]。自嗜是否可能作為調(diào)節(jié)酶原顆粒的角色，從而去適應(yīng)胰腺腺泡和整個器官的需求。然而自嗜在調(diào)節(jié)消化酶分泌的功能方面的作用沒被證實?；A(chǔ)和饑餓誘導(dǎo)的自嗜在胰腺腺泡細胞中是非選擇性的，因為在兩者的自嗜體中包含許多細胞器，例如、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、酶原顆粒。并且還發(fā)現(xiàn)饑餓誘導(dǎo)的自嗜體在腺泡細胞中導(dǎo)致酶原顆粒的顯著減少[4]。

2.2 自嗜與胰腺炎關(guān)系 急性胰腺炎被認為是致命性的疾病，并伴有高的發(fā)病率和死亡率，它的發(fā)病機理目前不清楚[6]，也沒有特別有效的治療方法，被認為可能起始于腺泡細胞[5]。急性胰腺炎的特點包括高淀粉酶血癥、腺泡內(nèi)消化酶的激活、大空泡的積累和促炎介質(zhì)的產(chǎn)生，導(dǎo)致在胰腺中炎性細胞的浸潤，全身炎癥反應(yīng)，和腺泡細胞死亡。

在實驗動物和人的胰腺炎中腺泡細胞中都有空泡的積累，然而它們形成的機制及與其他的胰腺炎的病理反應(yīng)的關(guān)系仍不是很清楚。有研究[7，8]發(fā)現(xiàn)大多數(shù)空泡是自嗜空泡，與饑餓比較，不僅在腺泡中有更多空泡，而且更大，且自嗜空泡主要是自嗜溶酶體。與饑餓時相比，胰腺炎減少了自嗜的效率，使長壽蛋白降解受抑制[8]?？傊?，空泡的積累，自嗜降解效率的減低說明自嗜的功能受到損傷。研究還發(fā)現(xiàn)胰腺炎不影響自嗜體和溶酶體融合，也就是說自嗜溶酶體和底物的積累,說明溶酶體的水解酶的活性受了影響。由此可見，急性胰腺炎中自嗜功能受到損傷。

Grasso D等[9,10]研究中發(fā)現(xiàn)在腺泡細胞中，空泡膜蛋白1(VMP1)與自嗜有關(guān)，且與重要蛋白LC3和Beclin 1都有相互作用。研究發(fā)現(xiàn)在胰腺炎中VMP1的過表達起著對腺泡有保護作用，且與泛素化蛋白酶USP9x和泛素化連接蛋白P62有關(guān)，所以提出了一種新型的選擇性VMP1-USP9x-p62介導(dǎo)的自噬通路，它被VMP1調(diào)控，可有選擇的去降解過早激活的酶原顆粒，這條通路是被胰腺炎誘導(dǎo)[9]。以上研究中發(fā)現(xiàn)在蛙皮素干預(yù)后1h，VMP1的調(diào)控發(fā)生了作用,而空泡的積累和胰酶的增加發(fā)生在干預(yù)后30min,說明自嗜損傷先于VMP1的調(diào)控作用。這種途徑通過對過早激活的酶原顆粒的清除，從而起到保護的作用。

2.3 胰腺炎中溶酶體在自嗜中的作用 溶酶體在自嗜過程中發(fā)揮著重要的作用，那么溶酶體功能的障礙可引起自嗜損傷，例如：溶酶體蛋白水解酶活性減弱。在大約20年前，有研究發(fā)現(xiàn)，在急性胰腺炎中組織蛋白酶B(CatB)活性的顯著降低，CatB是一種重要的酸性水解酶。研究[11]還發(fā)現(xiàn)這樣的減少并不是僅發(fā)生在CatB中，但是發(fā)生在許多溶酶體水解酶中，包括CatL、CatD、肽鏈內(nèi)切酶、硫酸酯酶等。有研究[8]發(fā)現(xiàn)在胰腺炎中組織蛋白酶形成過程的損傷，可導(dǎo)致成熟形式的減少，這就很好解釋他們?yōu)槭裁椿钚越档汀?/p>

此外，Boonen等[12]在Gnptab-的小鼠中研究中，發(fā)現(xiàn)在腺泡細胞中有增大的自嗜溶酶體，以及自嗜溶酶體和底物的積累，說明顯示溶酶體的降解能力減低導(dǎo)致了自嗜的損傷。因為糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶可使甘露糖-6-磷酸(M6P)附加到水解酶上，使它作為溶酶體的識別信號，而這個酶的亞基被Gnptab和Gnptg編碼。表明溶酶體中水解酶的減少，可以引起自嗜損傷。

3 自嗜溶酶體途徑在胰腺炎病理發(fā)展過程中的作用

胰酶的激活和積累是胰腺炎的早期重要特征，胰酶激活的部位一直是國內(nèi)外學(xué)者爭論的焦點，它的分子機制和病理作用也一直在被研究。自嗜損傷的特征被發(fā)現(xiàn)在人類和動物模型的胰腺炎中，自嗜損傷發(fā)生在疾病發(fā)展中的早期，且可能與胰酶的激活和炎癥反應(yīng)有著密切關(guān)系。

Hayashi-Nishino M等研究[13]發(fā)現(xiàn)在Atg5基因敲除的小鼠中，胰蛋白酶原的激活和空泡的積累顯著減少，那么自嗜可能與酶原激活有著密切關(guān)系。最近研究[14,15]發(fā)現(xiàn)CatB和CatL在這個過程中起到關(guān)鍵作用，兩者的作用相反，CatB具有使胰蛋白酶原轉(zhuǎn)化為胰蛋白酶的作用，但CatL不具有激活胰蛋白酶原的作用，而具有水解胰蛋白酶的作用。當自嗜損傷時，兩種酶的平衡失調(diào)，即CatB的水平低于CatL，導(dǎo)致胰蛋白酶在自嗜泡中積累。

胰酶的激活通常被認為是腺泡損傷的起始因素，它為胰腺消化學(xué)說提供了分子基礎(chǔ)。但是胰酶的激活對胰腺炎的發(fā)展似乎是有限的。Gaiser S等[16]研究發(fā)現(xiàn)腺泡內(nèi)高水平的基因改造過的胰蛋白酶的激活可以引起急性胰腺炎，然而它不能持續(xù)的引起腺泡的損傷，和向慢性胰腺炎轉(zhuǎn)變的進程。Dawra R等[17]發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶原7亞型敲除小鼠急性胰腺炎模型腺泡細胞內(nèi)胰酶激活水平明顯降低且胰腺腺泡細胞壞死只占到野生型小鼠模型的50%，但是與野生型急性胰腺炎模型具有相似的局部和全身炎癥程度和NF-κB轉(zhuǎn)錄活性,這提示急性胰腺炎局部和全身炎癥進程并不一定需要胰酶激活。那么胰蛋白酶原的激活可能引起早期的腺泡損傷，但不引起胰腺炎的進展。

通過以上研究發(fā)現(xiàn)胰酶在腺泡內(nèi)的積累在胰腺炎中的作用很重要，但它的作用也是有限的。但是自嗜可能在胰腺炎發(fā)展過程中起到一個關(guān)鍵的作用。自嗜的損傷不但可以引起腺泡內(nèi)空泡的積累和胰酶的激活，而且可以引起炎癥反應(yīng)和細胞的死亡。那么自嗜損傷與胰腺炎中細胞的死亡和炎癥反應(yīng)的機制仍是不明確的。有一種機制可能是損傷的線粒體的積累促進細胞的死亡[18]，因為線粒體的損傷可使ATP減少，ROS生產(chǎn)過剩，并最終引起細胞的壞死和凋亡性死亡。過剩的ROS可引起炎性體的活化，并引起炎癥反應(yīng)。而正常的自嗜可清除這些損傷的線粒體，從而減少病理反應(yīng)。例外還可能與P62的積累有關(guān)，P62參與選擇性自嗜，并通過自嗜降解，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它的積累與神經(jīng)病變和肝臟疾病關(guān)系密切，它可能作為氧化應(yīng)激和NF-κB通路的調(diào)節(jié)點，它的積累可能會導(dǎo)致炎癥和細胞的死亡[19]。

4 展望

自嗜在胰腺炎中的探索才剛剛開始，還有許多問題需要解決。比如，分子伴侶依賴性自嗜、小自嗜和分泌自嗜在正常胰腺和胰腺炎中的作用，還有選擇性自嗜通路探索，比如線粒體自嗜、脂類自嗜和VMP1-USP9x-p62介導(dǎo)的自噬等。其中，線粒體自嗜、脂類自嗜在小鼠急性酒精性肝損害中起到保護作用[20,21]。此外，Rickmann M等[22]發(fā)現(xiàn)自嗜可能調(diào)節(jié)胰腺星狀細胞的激活，說明自嗜損傷還可能與慢性胰腺炎有關(guān)。

鈣信號通路被認為在胰腺炎發(fā)展的起到重要作用，在腺泡細胞中它可能涉及自嗜的調(diào)節(jié)，因為組織中過度鈣的內(nèi)流可以抑制空泡的積累和自嗜損傷引起其它特征[23]。NF-κB通路在胰腺炎機制中也起到重要作用，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[17,24]。且有研究顯示表明抑制NF-κB通路還可減少自噬相關(guān)蛋白LC3和beclin1表達[25]。說明自嗜可能與其他的調(diào)控機制有著密切的關(guān)系。

自嗜損傷的機制目前仍不是很清楚，對其機制的研究為治療胰腺炎提供新的思路。自嗜對胰腺炎的治療不是簡單的增強或阻礙自嗜。所以，我們要研究自嗜，使損傷的自嗜體恢復(fù)正常，從而達到治療胰腺炎的目的。

[1]Crotzer VL，Blum JS.Autophagy and intracellular surveillance:Modulating MHC class II antigen presentation with stress[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(22):7779-7780.

[2]Mizushima N.Autophagy:process and function[J].Genes Dev,2007,21(22):2861-2873.

[3]Mizushima N,Yoshimorim T,Levine B.Methods in mammalian autophagy research[J].Cell,2010,140(3):313-326.

[4]Mizushima N,Yamamoto A,Matsui M,et al.In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker[J].Mol Biol Cell,2004,15(3):1101-1111.

[5]舒宏春,陳幼祥.急性胰腺炎肺損傷致病因子研究進展[J].江西醫(yī)藥,2005,40(9):572-575.

[6]Pandol SJ,Saluja AK,Imrie CW,et al.Acute pancreatitis:bench to the bedside[J].Gastroenterology,2007,132(3):1127-1151.

[7]Gukovsky I,Gukovskaya AS.Impaired autophagy underlies key pathological responses of acute pancreatitis[J].Autophagy,2010,6(3):428-429.

[8]Mareninova OA,Hermann K,French SW,et al.Impaired autophagic flux mediates acinar cell vacuole formation and trypsinogen activation in rodent models of acute pancreatitis[J].J Clin Invest,2009,119(11):3340-3355.

[9]Grasso D,Ropolo A,Lo Re A,et al.Zymophagy,a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62,prevents pancreatic cell death[J].J Biol Chem,2011,286(10):8308-8324.

[10Ropolo A,Grasso D,Pardo R,et al.The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells[J].J Biol Chem,2007,282(51):37124-37133.

[11]Van Acker GJ,Weiss E,Steer ML,et al.Cause-effect relationships between zymogen activation and other early events in secretagogue-induced acute pancreatitis[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2007,292(6):G1738-1746.

[12]Boonen M,van Meel E,Oorschot V,et al.Vacuolization of mucolipidosis type II mouse exocrine gland cells represents accumulation of autolysosomes[J].Mol Biol Cell,2011,22(8):1135-1147.

[13]Hayashi-Nishino M,Fujita N,Noda T,et al.A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation[J].Nat Cell Biol,2009,11(12):1433-1437.

[14]Wartmann T,Mayerle J,Kahne T.Cathepsin L inactivates human trypsinogen,whereas cathepsin L-deletion reduces the severity of pancreatitis in mice.Gastroenterology[J].2010,138(2):726-737.

[15]Mareninova OA,Hermann K,French SW,et al.Impaired autophagic flux mediates acinar cell vacuole formation and trypsinogen activation in rodent models of acute pancreatitis[J].J Clin Invest,2009,119(11):3340-3355.

[16]Gaiser S,Daniluk J,Liu Y,et al.Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis[J].Gut,2011,60(10):1379-1388.

[17]Dawra R,Sah RP,Dudeja V,et al.Intra-acinar trypsinogen activation mediates early stages of pancreatic injury but not inflammation in mice with acute pancreatitis[J].Gastroenterology,2011,141(6):2210-2217.

[18]Green DR,Galluzzi L,Kroemer G.Mitochondria and the autophagy-inflammation-Cell death axis in organismal aging.Science,2011,333(6046):1109-1112.

[19]Johansen T,Lamark T.Selective autophagy mediated by autophagic adapter proteins[J].Autophagy,2011,7(3):279-296.

[20]Czaja MJ.Functions of autophagy in hepatic and pancreatic physiology and disease[J].Gastroenterology,2011,140(7):1895-1908.

[21]Ding WX,Li M,Chen X,et al.Autophagy reduces acute ethanolinduced hepatotoxicity and steatosis in mice[J].Gastroenterology,2010,139(5):1740-1752.

[22]Rickmann M,Vaquero EC,Malagelada JR,et al.Tocotrienols induce apoptosis and autophagy in rat pancreatic stellate cells through the mitochondrial death pathway[J].Gastroenterology,2007,132(7):2518-2532.

[23]Kim MS,Lee KP,Yang D,et al.Genetic and pharmacologic inhibition of the Ca2+influx channel TRPC3 protects secretory epithelia from Ca2+-dependent toxicity[J].Gastroenterology,2010,140(7):2107-2115.

[24]袁堂戰(zhàn),郭會文,蔣珂.N-乙酰半胱氨酸聯(lián)合維生素E對大鼠急性出血壞死性胰腺炎NF-κB的作用研究[J].江西醫(yī)藥,2012,47(8):680-682.

[25]Yang S,Bing M,Chen F,et al.Autophagy regulation by the nuclear factor κB signal axis in acute pancreatitis[J].Pancreas,2011,41(3):367-373.