賈永宏，馬國際，王春偉，洪潔赟，胡建宏*

(1．陜西省家畜改良站，陜西 涇陽 713702；2．西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

從20世紀(jì)科學(xué)家開始研究家畜精液冷凍技術(shù)開始，經(jīng)過多年不斷的深入探索，目前牛的冷凍精液已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)，廣泛用于人工授精技術(shù)。目前牛的冷凍精液在家畜中最為成功，但冷凍-解凍過程發(fā)生的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)降低了精子質(zhì)量，并導(dǎo)致40%～50%的精子失去活力。在稀釋液中添加抗氧化劑可以清除精液冷凍-解凍過程中產(chǎn)生的過多活性氧(reactive oxygen species, ROS)，提高精子抗氧化損傷的能力，進(jìn)一步提升家畜冷凍精液的質(zhì)量。本文就目前一些主要的維生素、抗氧化酶等抗氧化劑在家畜精液冷凍保存中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步提高家畜冷凍精液的品質(zhì)提供一定的基礎(chǔ)，切實(shí)提高家畜冷凍精液的質(zhì)量。

1 精液冷凍-解凍過程氧化損傷機(jī)理

在冷凍-解凍過程中，很多物理和化學(xué)反應(yīng)發(fā)生在精子膜上，降低了精子活力和受精能力。Aitken等[1]研究認(rèn)為，ROS通過引發(fā)精子膜上的多聚不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，由于產(chǎn)生大量脂類過氧化物，導(dǎo)致精子膜不可逆地被破壞或消失，直接抑制精子的運(yùn)動(dòng)性能。精子存活率的高低反映精子生存能力和精子質(zhì)量的優(yōu)劣，而精子運(yùn)動(dòng)能力是正常成熟精子的重要功能，是精子受精能力高低的重要指標(biāo)之一。Chatterjee等[2]研究認(rèn)為，在冷凍精液的制作過程中，由于外界各種因素的相互作用，增加了死亡精子和受損精子的數(shù)量，導(dǎo)致產(chǎn)生ROS。精子的冷應(yīng)激和冷凍損傷都是由ROS和氧應(yīng)激的產(chǎn)生所引起，過氧化損傷是冷凍-解凍后精子質(zhì)量下降的重要原因。在正常生理?xiàng)l件下，精子的ROS處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，在精液的冷凍-解凍過程中因精子與外界環(huán)境相接觸，致使這種平衡狀態(tài)被打破，精子ROS增加，引起精子膜的流動(dòng)性改變，線粒體和DNA損傷，降低了精液品質(zhì)[2]。

2 抗氧化劑對冷凍精液品質(zhì)的影響

2.1 維生素類抗氧化劑

2.1.1 維生素E 維生素E又名α-生育酚，是動(dòng)物身體重要的抗氧化劑，對組織線粒體、網(wǎng)狀組織或漿膜的磷脂有著特殊的親和性，并且存在于細(xì)胞膜的特定部位。Ball等[3]研究認(rèn)為，在馬的精液稀釋液中添加維生素E后明顯提高了精子活力和頂體完整率，說明維生素E對精子具有冷凍損傷具有保護(hù)作用。羅海玲等[4]研究認(rèn)為，綿羊冷凍精液的稀釋液中補(bǔ)充維生素E后，因?yàn)樽杂苫男纬墒艿揭种?，有效預(yù)防或阻止脂質(zhì)過氧化的誘發(fā)，保護(hù)精子細(xì)胞膜免受氧化損傷，同時(shí)保護(hù)了精子膜酶的活性。Pena等[5]研究證明，在豬冷凍精液稀釋液中加入維生素E可以改善凍后精子質(zhì)量，但其添加量不應(yīng)超過200 μg/ mL，否則對精子產(chǎn)生一定的毒害作用。在牛的冷凍精液稀釋液中添加維生素E后，不僅能夠有效提高精子的運(yùn)動(dòng)性能和頂體完整率，而且能夠顯著提高過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD) 、谷胱甘肽過氧化物酶( GSH) 、谷胱甘肽還原酶( GR) 的活性[6]。Hu等[7]研究表明，稀釋液中添加維生素E能夠增強(qiáng)牛精子抗氧化酶的活性，從而提高精子冷凍-解凍后的質(zhì)量，其適宜劑量為1.5 mg/ml。Sicherle等[8]研究認(rèn)為，稀釋劑中補(bǔ)充維生素E的相似物(Trolox)也能夠顯著降低由于氧化應(yīng)激導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化，但精子功能損傷的具體機(jī)制不甚清楚，有待于進(jìn)一步深入探索。

2.1.2 維生素C 維生素C又稱為抗壞血酸維生素C，是一種抗氧化物質(zhì)，能夠有效防止精液冷凍過程中精子磷脂發(fā)生過氧化反應(yīng)，提高凍后精子質(zhì)量。Foote等[9]研究證實(shí)，稀釋液中添加維生素C可以明顯減少丙二醛(MDA)的含量，提高冷凍-解凍后牛精子的活力。在低溫保存條件下，由于精子暴露在有氧環(huán)境中，發(fā)生氧化反應(yīng)而產(chǎn)生自由基，致使細(xì)胞高度突變和異化，減弱精子的受精能力。Mustafa等[10]研究發(fā)現(xiàn)，羊精液稀釋液中添加的維生素C含量不高于2 mg/ml時(shí)，對精子運(yùn)動(dòng)性能和形態(tài)無明顯影響，但如果添加量達(dá)到5～10 mg/mL時(shí)，則可明顯抑制精子的代謝，延長精子的存活時(shí)間，這可能與維生素C偏酸有關(guān)。Cheede等[11]研究表明，稀釋液中補(bǔ)充維生素C明顯改善了精液質(zhì)量，提高了人工授精后水牛的受胎率。趙憲林等[12]用含有維生素C的冷凍稀釋液冷凍奶牛X精子，發(fā)現(xiàn)在短時(shí)間解凍后精子活率變化不顯著，但隨著解凍時(shí)間的延長，維生素C具有減緩精子死亡的作用，且證明其添加量為4～6 mg/mL時(shí)可有效提高荷斯坦公牛X精子解凍后的活率、質(zhì)膜完整率及頂體完整率。

2.1.3 維生素B12維生素B12是一種含鈷的三價(jià)化合物，又名鈷維生素，是一種生理活性物質(zhì)，能夠改善精子的外在環(huán)境，提高精子的活力。維生素B12的輔酶能使氧化型(-S-S-)輔酶A還原成還原型(-SH-)輔酶A，滿足酶反應(yīng)的需要，同時(shí)也可使氧化型谷胱甘肽和高胱氨酸還原成還原型，而還原型谷胱甘肽對精子代謝發(fā)揮重要活性。李玉凡等[13]發(fā)現(xiàn)維生素B12注射液解凍奶牛顆粒凍精可提高精子頂體完整率，降低精子畸形率。孫淑琴等[14]研究表明，在稀釋液中采用一定濃度的維生素B12注射液作為保護(hù)精子的添加劑是可行的，但當(dāng)其濃度達(dá)1%時(shí)，精子活力降低，其作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

2.2 酶類抗氧化劑

動(dòng)物精子抗氧化系統(tǒng)中的主要成分有超氧化物歧化酶( SOD)、谷胱甘肽還原酶( GSH)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)、輔酶Q10以及精子本身所具有的還原型輔酶Ⅱ(NADPH)依賴性谷胱甘肽過氧化酶與還原酶(GR)系統(tǒng)等[15-16]，可以清除O2-、H2O2等，防止過氧化反應(yīng)的產(chǎn)生。精子的抗氧化體系中SOD、CAT、GSH和GSH-Px對維持家畜精子的活力和運(yùn)動(dòng)能力發(fā)揮重要作用。但是，精液冷凍-解凍后其抗氧化酶的活性下降，不能滿足消除過多ROS的需要，因而可在精液冷凍時(shí)適當(dāng)添加一定量的抗氧化酶類，減少精子的氧化損傷[17-18]。Kasimanickam等[19]研究證明，GSH-Px、SOD對保護(hù)羊精液免受ROS的毒害具有非常重要的作用。Sariozkan等[20]比較了GSH-Px、GSH和牛血清白蛋白(BSA)對牛精子活力、頂體異常率、質(zhì)膜完整性、抗氧化酶活性以及精子受精能力的影響，表明稀釋液中添加BSA時(shí)母牛妊娠率最高。張文舉等[21]在牛精液稀釋中添加GSH后發(fā)現(xiàn)精子活力和母牛受胎率明顯提高。易康樂等[22]研究發(fā)現(xiàn)，冷凍保存液中加入300 IU/mL的SOD 或1.0 mM GSH，可以顯著提高水牛精子凍后活率、存活時(shí)間以及囊胚孵化率。Tuncer等[23]研究了半胱氨酸和谷胱甘肽對牛精子氧化應(yīng)激的影響，發(fā)現(xiàn)對精子形態(tài)影響不顯著，但精子DNA的損害程度降低。

2.3 其他抗氧化劑

海藻糖是一種非還原性糖，性質(zhì)穩(wěn)定，可以減緩細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的變化，從而保護(hù)細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)不被破壞。Chen[24]等研究證明，海藻糖能提高冷凍保存的牛精子活力，延長精子存活時(shí)間。昝林森等[25]研究表明，單獨(dú)添加海藻糖、牛血清白蛋白(BSA)及其相互配伍對牛精液的冷凍效果顯著優(yōu)于對照組。稀釋液中單獨(dú)添加不同水平的海藻糖或BSA 對凍后牛精子活率和質(zhì)膜完整率均有明顯影響，但對頂體完整率影響不大。Hu等[26]的研究表明，稀釋液中添加海藻糖可以降低由冷凍-解凍引起的氧化應(yīng)激，提高冷凍-解凍后牛精液品質(zhì)。

褪黑激素具有高親脂性和部分親水性，能夠抑制過氧化氫引起的過氧化脂質(zhì)含量的升高，有效清除在化學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生的羥自由基，對細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化作用[27]。李博玲等[28]分別在稀釋液中單獨(dú)添加褪黑素、谷胱甘肽或兩者聯(lián)合添加，發(fā)現(xiàn)均能減少豬精液冷凍過程中ROS的生成，顯著提高凍后精子質(zhì)量，并且聯(lián)合添加效果顯著優(yōu)于單獨(dú)添加效果。張渭斌等[29]試驗(yàn)表明，稀釋液中補(bǔ)充0.2、0.4 mg/mL的咖啡因時(shí)，豬精子冷凍后活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率顯著高于其他組。Jiang等[30]的研究認(rèn)為，稀釋液中添加低密度脂蛋白能夠有效提高豬精液品質(zhì)。張婷等[31]、潘巧蓮等[32]分別將海帶多糖和紅景天多糖添加到豬精液的冷凍稀釋液中，結(jié)果表明這兩種多糖均可以有效提高精子在冷凍過程中抵抗氧化損傷的能力，改善精液質(zhì)量。

3 抗氧化劑研究存在問題與發(fā)展

精液冷凍保存作為一種先進(jìn)的繁殖技術(shù)，在提高優(yōu)良種公畜的配種效率、加快品種改良進(jìn)程、疾病防治及提高經(jīng)濟(jì)效益等方面發(fā)揮著重要作用。多年來，科學(xué)家一直嘗試在家畜冷凍精液稀釋液或者解凍液中添加各種抗氧化劑，以便清除冷凍-解凍過程中產(chǎn)生的過多活性氧，以便能夠切實(shí)提高家畜冷凍精液的質(zhì)量。但是，眾多研究發(fā)現(xiàn)，家畜冷凍精子超微結(jié)構(gòu)的變化基本發(fā)生在解凍期，而冷凍狀態(tài)下精子的質(zhì)膜、頂體以及線粒體結(jié)構(gòu)基本正常。因此，進(jìn)一步探索在家畜冷凍精液稀釋液中添加適宜的抗氧化劑，探討其作用機(jī)理，對進(jìn)一步提高冷凍精液的質(zhì)量具有非常重要的意義[33]。

雖然抗氧化劑在家畜精液冷凍保存中的應(yīng)用對于提高精子質(zhì)量作用顯著，但目前不同報(bào)道的抗氧化劑尤其是維生素類抗氧化劑在家畜精液冷凍保存中應(yīng)用結(jié)果不盡一致，還需要進(jìn)一步深入探究和分析。另外，大多研究主要集中于單獨(dú)加入抗氧化劑的研究方面，很少涉及不同抗氧化劑聯(lián)合在家畜精液冷凍保存中的應(yīng)用，同時(shí)關(guān)于各抗氧化劑是否有協(xié)同作用研究也較少，特別是維生素類和酶類抗氧化劑的聯(lián)合應(yīng)用，應(yīng)該加大不同抗氧化劑聯(lián)合應(yīng)用，以便更好的改善冷凍解凍后精子質(zhì)量。因此，在家畜精液冷凍保存技術(shù)的優(yōu)化方案尤其是稀釋液配方的配伍上，應(yīng)深入開展具有良好抗氧化作用的抗氧化劑方面的研究，這是今后家畜精液冷凍保存研究中值得重視的主要環(huán)節(jié)之一。

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