■張立霞 李艷玲 屠 焰 張乃鋒 劉 策 刁其玉

（中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點開放實驗室，北京100081）

植物纖維素是一種很重要的可再生資源，但是大量的纖維素并沒有被合理利用，而是被焚燒或者被隨意丟棄。因此，國內(nèi)外做了很多關(guān)于降解纖維素的微生物的研究，目前主要集中在康寧木霉、里氏木霉、黑曲霉等方面，用于固態(tài)發(fā)酵和堆肥。纖維素是植物材料的主要成分，在一定條件下可以被水解成單糖，單糖可以被動物直接利用，或者是通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)各種有用的產(chǎn)品，如飼料、食品、藥品。植物纖維素中產(chǎn)量最大的是農(nóng)作物秸稈，秸稈除了焚燒，大部分用于堆肥返田，利用效率及經(jīng)濟效益都不高。如果能找到高效降解農(nóng)作物秸稈的微生物或者微生物組合，進行發(fā)酵降解其中的纖維素和木質(zhì)素，提高秸稈的營養(yǎng)價值，并進行進一步的加工，將農(nóng)作物秸稈大量轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)價值較高的動物飼料，將大大提高農(nóng)作物秸稈的利用率。

秸稈利用率不高的主要原因是較高的木質(zhì)素、纖維素含量，其不僅阻礙了動物體對秸稈的利用，同時也是生產(chǎn)生物酒精、糖等的障礙[1]。但是，經(jīng)過微生物處理后纖維素的降解率仍然不高，主要是因為木質(zhì)素形成的骨架結(jié)構(gòu)阻礙了微生物對纖維素的降解。因此，本試驗旨在尋找能高效降解木質(zhì)素和纖維素的微生物組合，用于提高秸稈的營養(yǎng)價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

黃孢原毛平革菌(Phaerochaete chrysosporium 5.776），購于中科院微生物菌種保藏中心,編號PC；黑曲霉（Aspergillus niger）SY1-2分離自四川鹽湖的土壤中；青霉菌（Penicillium sp.）SP-1、瓶霉（Phialophora spp.）G5分離于云南錫礦的酸性廢水中；毛殼霉（Chaetomium）SZ-8分離于沙土中；綠色木霉（Trichoderma viride）Y-1分離于瑞萊德微生物催熟劑中；以上來源于中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所生物化學與分子實驗室，所有菌種保藏于PDA培養(yǎng)基中，置于4℃冰箱中。

1.1.2 材料

玉米秸稈，來源于北京通州，自然晾干，粉碎過40目篩，放于自封袋保存。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA：39 g粉末（DifcoTMPotato Dextrose Agar,BD公司）溶于1 L水中，121℃滅菌15 min。試驗菌株孢子長滿斜面后用無菌水制成孢子懸液，利用血球計數(shù)板計數(shù)，達到108個/ml。

PDB：24 g粉末（DifcoTMPotato Dextrose Agar,BD公司）溶于1 L水中,121℃滅菌15 min。

剛果紅篩選纖維素瓊脂培養(yǎng)基：CMC-Na 1.88 g、明膠 2 g、剛果紅 0.2 g、KH2PO40.5 g、Mg?SO4·7H2O 0.25 g、瓊脂 15 g，自然pH值，用蒸餾水定容至1 L。121 MPa、20 min滅菌備用。使用前加100 μl氨芐青霉素。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取20 g秸稈,加入5 g的麩皮,按質(zhì)量與體積比1∶1(w/v)的Mendel營養(yǎng)液[2],充分攪拌，120℃濕熱滅菌20 min后，置于恒溫培養(yǎng)箱中30℃，發(fā)酵10 d，每天取樣測定酶活。10 d后，取出樣品，烘干測定NDF(中性洗滌纖維)、ADF(酸性洗滌纖維)、ADL(酸性洗滌木質(zhì)素)。

1.2 菌種篩選

1.2.1 纖維素分解菌的篩選[3]

采用菌餅接種法[4]將長滿均勻孢子，d=4 mm的菌餅接種到剛果紅纖維素培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，出現(xiàn)透明水解圈的菌株為纖維素降解菌，測定菌落直徑（d，cm）和水解圈直徑（D，cm），采用D0=D/d表示水解能力。纖維素剛果紅平板透明圈直徑與菌落直徑(d)的比值(D/d)可以用于初步判斷纖維素降解菌酶活力的大小，其大小直接反映了纖維素酶濃度的相對高低[5]。

1.2.2 纖維素分解菌酶活的測定

將初篩得到的菌株在PDA上培養(yǎng)，用接種環(huán)將新鮮菌絲接種于PDB中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，每天取樣測定纖維素酶酶活。

1.2.3 纖維素分解菌與黃孢原毛平革菌組合降解秸稈的效果

將組合菌株按孢子數(shù)以等比例接種在秸稈固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，每天取樣測定纖維素酶活、木質(zhì)素降解酶活，發(fā)酵10 d后，將發(fā)酵樣品取出，65 ℃烘干2 d，測定秸稈NDF、ADF、ADL及纖維素、半纖維素的含量。

1.3 酶活測定

粗酶液的制備：發(fā)酵樣取出后按1∶10的比例加入去離子水，于150 r/min搖床上振蕩1 h，濾紙過濾，濾液作為粗酶液。

①濾紙酶活測定(Ghose,1987)

在pH值5.0、50℃條件下，在50 mmol/l的磷酸氫二納-檸檬酸緩沖液中測定。

校正：1.5 ml 50 mmol/l磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,加入3.0 ml DNS,煮5 min,540 nm測定OD值,用于校正分光光度計的0值。

酶液對照：1.0 ml 50 mmol/l磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,加入0.5 ml酶液和3.0 ml DNS,煮5 min,540 nm測定OD值,和0值相比得到酶液對照。

標準液的制備：葡萄糖在100℃烘2 h至恒重,配成10 mg/ml儲存液，并作表1的稀釋梯度。

表1 不同濃度的葡萄糖標準溶液

標準曲線的制作：0.5 ml不同濃度葡萄糖標樣，加入1.0 ml 50 mmol/l磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和3.0 ml DNS，煮5 min后加入20 ml蒸餾水，540 nm測定OD值，測定得到的值要減去酶液對照的值。

酶活定義為：每分鐘轉(zhuǎn)化底物生成1 μmol產(chǎn)物所需要的酶量。最終得到在反應體系中釋放2 mg葡萄糖的酶活力為0.37 U/ml。

酶活測定條件：在上述同樣條件下,加入1 cm×6 cm濾紙作為底物,加入1.0 ml pH值5.0、50 mmol/l磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和0.5 ml酶液,50℃反應60 min,測定酶活。

②羧甲基纖維素酶活（CMCase）的測定

2%低黏度CMC-Na，同上方法制備濃度為2 mg/ml的儲存液，進行梯度稀釋見表2。

表2 不同濃度的CMC-Na溶液

校正空白：0.5 ml底物,在50 ℃放置30 min,加入3 ml DNS和0.5 ml緩沖液,煮5 min,加入20 ml蒸餾水,在540 nm測OD值,用于分光光度計調(diào)0。

酶液對照：0.5 ml底物,在50 ℃放置30 min,加入3 ml DNS 和0.5 ml酶液,煮5 min,加入20 ml蒸餾水,在540 nm下測OD值,和校正空白相比得出酶液對照。

標準曲線：0.5 ml底物,在50 ℃放置30 min,加入3 ml DNS和0.5 ml不同濃度標樣,煮5 min,加入20 ml蒸餾水,在540 nm下測OD值,減去酶液對照。

酶活定義為：每分鐘轉(zhuǎn)化底物生成1 μmol產(chǎn)物所需要的酶量。

將0.5 ml的酶液預熱至50℃,后加入0.5 ml底物進行反應,按標準反應測定酶活。

③以pNPG為底物測定糖苷酶酶活

250 μl底物,加入250 μl適當稀釋的酶液,在一定溫度下反應10 min，加入1.5 ml 1 M Na2CO3溶液，在405 nm處測定OD值(Baldrian等，2006)。

酶活單位定義為：在最適溫度和條件卜,每分鐘釋放1 μmol pNPG所需耍的酶量(U/ml)。

④木聚糖酶酶活測定

木聚糖酶酶活測定采用DNS法(Miller，1959)，反應體系包括100 μl酶液和900 μl樺木木聚糖,在50 mM、pH值5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中,50℃反應10 min,加入1.5 ml DNS,煮5 min終止反應,在540 nm處測定OD值。

⑤Lac漆酶酶活的測定

參見吳坤（2002）的方法[6]。

⑥Mnp酶活的測定

參見王佳玲（1998）的方法。

⑦木質(zhì)素過氧化物酶(Lip)活力的測定

參見燕紅等（2011）的方法[7]。

2 結(jié)果

2.1 纖維素降解菌的篩選（見圖1、表3）

圖1 纖維素降解菌產(chǎn)生的透明圈

剛果紅培養(yǎng)基作為篩選培養(yǎng)基，可以很快識別出纖維降解能力的高低，方便了篩選。從圖1和表3中可看到，試驗所用菌株A4、A5在32 h沒有產(chǎn)生透明圈，A7在32 h時產(chǎn)生的透明圈較小。測量不同菌株的D/d的比值發(fā)現(xiàn)，A1、A2的D/d的比值分別為1.65和1.68，且在試驗的8 h時已經(jīng)產(chǎn)生了明顯的透明圈，同時A2的菌絲在培養(yǎng)基上的生長速度較快。A6和A8都屬于木霉屬，D/d的比值一樣，但是A8的生長速度比A6快。所以在本試驗中選擇A2、A3、A8和PC作為初步篩選的纖維素降解菌株。

表3 各菌株的D/d比值和生長情況

纖維素降解菌可以產(chǎn)生纖維素酶，而纖維素酶是一種多組分的酶系，是能夠降解β-1,4-糖苷鍵的水解酶的組合，天然纖維素正是在這種復合水解酶的協(xié)同作用下被降解。現(xiàn)今，纖維素酶水解的機制仍無統(tǒng)一的共識，但目前較為普遍的是協(xié)同理論，即纖維素降解酶普遍認為是所有參與降解纖維素的各種酶的總稱，主要包括外切葡聚糖酶(CBH)、內(nèi)切葡聚糖酶(EG)和β-葡聚糖酶(BG)。外切酶將纖維素分子分解為短鏈分子，再由內(nèi)切酶進行切割，形成纖維二糖，最終由β-葡聚糖酶降解成葡萄糖。在秸稈中半纖維素降解酶主要是木聚糖酶，與纖維素酶具有很好的協(xié)同性[8]。故測定相應菌株的4種酶活即可以反映降解纖維素能力的大小。為進一步驗證上述試驗中所得出的A2、A3、A8和PC作為初篩纖維素降解菌，在本試驗中，分別測定了FPA、CMCase、β-葡糖苷酶用來作為鑒定菌種纖維素分解能力的大小，同時測定了木聚糖酶的活性作為比較半纖維素分解能力的指標(見圖2～圖5)。

圖2 不同真菌在PDB中的FPA活性

對剛果紅試驗篩選到的菌株進行產(chǎn)酶能力的比較，發(fā)現(xiàn)FPA、β-葡糖苷酶的產(chǎn)酶高峰均在第4 d出現(xiàn)，而CMCase、木聚糖酶的產(chǎn)酶高峰在第2 d。FPA代表總纖維素酶活力，從圖2可以看出，PC和木霉A8 FPA酶活性明顯高于其他真菌，分別為0.114、0.112 U/ml，A6的CMCase的活力最高，A2的木聚糖酶活力最高，A3的β-葡糖苷酶活性最高，為0.801 U/ml。A2的β-葡糖苷酶的活性比A1的低，A2其他3種酶都比A1的高（但是在第5 d，CMCase A1＞A2，可能與測定酶活過程中試驗操作及底物濃度的控制有關(guān)）。A8的β-葡糖苷酶活性比A6低，但是A8的FPA活力高于A6，與前面剛果紅試驗中得出的結(jié)論相符。

圖3 不同真菌在PDB中的CMCase的活性

圖4 不同真菌在PDB中β-葡糖苷酶的活性

圖5 不同真菌在PDB中的木聚糖酶活性

2.2 纖維素分解菌與黃孢原毛平革菌組合降解玉米秸稈（見表4）

在將菌株進行組合前，進行了菌株間拮抗試驗，并沒有出現(xiàn)拮抗現(xiàn)象。將篩選得到的試驗菌株與黃孢原毛平革菌進行組合，固態(tài)發(fā)酵秸稈10 d，測定酶活，結(jié)果見表4。

從表4可以看出，PC+黑曲霉的FPA最高，為0.18 U/ml，PC+木霉的木聚糖酶最高，為0.47 U/ml；PC+黑曲霉+青霉+木霉的Mnp最高，達到了449.58 U/ml；PC+黑曲霉的Lip最高，為25.94 U/ml。不同菌株進行組合，測定了纖維素降解和木質(zhì)素降解的酶活，表現(xiàn)出協(xié)同降解纖維素和木質(zhì)素的效果。

表4 不同真菌組合固態(tài)降解玉米秸稈的酶活（U/ml）

2.3 黃孢原毛平革菌與纖維素降解菌復合降解秸稈的效果研究（見表5）

表5是不同菌株和復合菌株進行玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵10 d后，NDF、ADF、ADL、纖維素、半纖維素的含量。從表5中可以得出，經(jīng)過不同微生物處理的秸稈5種指標的含量比未經(jīng)處理的秸稈含量低。NDF含量較低的為黑曲霉、PC+木霉和PC+黑曲霉+青霉+木霉；黑曲霉、PC、PC+木霉、PC+黑曲霉+青霉和PC+黑曲霉+青霉+木霉的ADF含量比較低；ADL含量比較低的為黑曲霉、木霉、PC+黑曲霉和PC+黑曲霉+青霉+木霉；半纖維素含量最低的為PC+黑曲霉+青霉+木霉。

表5 不同真菌組合固態(tài)發(fā)酵玉米秸稈10 d后木質(zhì)纖維素的含量（DM,%）

不同菌株產(chǎn)生的纖維素酶的組分不同，與其他菌株進行組合后，不同酶組分相互協(xié)同，共同降解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，增加秸稈的營養(yǎng)價值。根據(jù)本試驗結(jié)果，篩選能夠較好降解纖維素和木質(zhì)素的組合為PC+黑曲霉+青霉+木霉。

3 討論

植物木質(zhì)纖維素是地球上最豐富且廉價的可再生資源，占地球上光合作物的60%以上，并且全球每年通過光合作用產(chǎn)生的植物約10 000億噸，因此，豐富的木質(zhì)纖維素是有待于利用的非常重要的資源。而植物秸稈木質(zhì)纖維素的降解一直是國內(nèi)外普遍關(guān)注的問題，且在利用物理方法和化學方法來處理秸稈方面取得了很多成就，但是理化處理一般可以去掉50%的木質(zhì)素并使纖維素成為非結(jié)晶態(tài)，但應用于工業(yè)化生產(chǎn)存在成本高、易造成再次污染的缺陷[9]。近年來，我國在微生物降解秸稈方面的研究非?；钴S，側(cè)重于纖維素分解菌的篩選[10]、纖維素酶活性的研究，也有一些關(guān)于真菌纖維素降解機理的報道[11]。利用微生物或者其產(chǎn)生的酶來降解秸稈不僅降解率高，而且安全環(huán)保，可再生。

3.1 纖維素分解菌的篩選

所有菌株酶活成分比較復雜，所以之前有進行統(tǒng)一標準的篩選。在篩選好氧單菌時常用的方法是剛果紅染色法。Teather等[12]認為剛果紅染料與水解后的多糖可形成濃郁色澤的復合物，可方便檢測透明圈。Hendrick等[13]將其發(fā)展為鑒別培養(yǎng)基。葉姜喻等[3]將其發(fā)展成一個方便快捷的培養(yǎng)基，即纖維素剛果紅培養(yǎng)基。以剛果紅為指示劑，透明圈明顯，效果顯著，減少了工作量，提高了工作效率。其原理是剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復合物，當纖維素被微生物分泌的纖維素酶分解后，剛果紅-纖維素的復合物便無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。透明圈出現(xiàn)的越早，越清晰，說明酶類產(chǎn)生的越早，纖維素酶降解越徹底，酶類也越齊全[14]。因此，剛果紅纖維素培養(yǎng)基常被用來快速識別微生物降解纖維素的能力。本試驗采用的菌餅接種法，在8 h時就已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的透明圈，培養(yǎng)32 h后進行菌落直徑和透明圈直徑的測量，得到產(chǎn)纖維素酶活力較高的4株菌A2、A3、A8和PC。PC除具有典型的降解木質(zhì)素的能力外，還具有降解纖維素的能力。將篩選得到的6株真菌在PDB中培養(yǎng)，測定纖維素酶的活性。CMC酶活反映的是纖維素酶組分中內(nèi)切酶的活性，F(xiàn)PA酶活反映的是纖維素酶全組分的活力[15]。本試驗中，以β-葡糖苷酶活性進行比較，青霉A3＞黑曲霉A1＞其他菌株；以CMCase活性進行比較，木霉A6＞PC＞其他菌株；以FPA活性進行比較，PC＞木霉A8＞其他菌株。以木聚糖酶活性進行比較，黑曲霉A2＞黑曲霉A1＞其他。根據(jù)透明圈的大小、菌絲體生長狀況和所測定酶活的大小，最終確定了黑曲霉A2、青霉A3、綠色木霉A8、PC作為篩選的最終菌株。

本試驗篩選到的4種真菌都是具有纖維素分解能力的菌株。青霉屬(Penicillium)是真菌中的一些不僅能分泌組成齊全、酶活較高的木質(zhì)纖維素降解酶系,而且具有易培養(yǎng)和生長快的優(yōu)勢。劉國棟研究顯示，經(jīng)過比較基因組學分析，斜臥青霉含有種類、數(shù)量更為豐富的木質(zhì)纖維素降解酶編碼基因，尤其是參與半纖維素降解的蛋白和含纖維素結(jié)合域蛋白的編碼基因。同時，斜臥青霉基因組織上存在植物細胞壁降解酶編碼基因密集分布的區(qū)域，部分木質(zhì)纖維素降解酶編碼基因可能來自金華中的水平轉(zhuǎn)移、擴張事件[16]。劉清鋒等在稻田腐爛秸稈中分離到一株青霉，培養(yǎng)基含3%稻草粉、0.25%尿素和無機鹽營養(yǎng)液,最佳產(chǎn)酶條件為：自然pH值，30℃、130 r/min發(fā)酵4 d。該菌株的CMC酶活和濾紙酶活最高分別達到45.01 IU/ml和6.89 IU/ml[17]。對黑曲霉的研究較多且全面，黑曲霉纖維素酶各組分均為糖蛋白，但含糖量和組成各不相同，含糖量分別為：β-葡糖苷酶11.3%，內(nèi)切β-葡聚糖酶11.8%，β-葡聚糖纖維二糖水解酶CBH-Ⅰ17.2%、CBH-Ⅱ5.8%[18]。纖維素酶各組分全面。綠色木霉也是一種常用的發(fā)酵秸稈的菌種。林元山等通過單因子及正交試驗,對綠色木霉AS3.5455固體發(fā)酵稻草秸稈確定最佳產(chǎn)酶條件為：稻草粉8 g、麩皮4 g，Mendels營養(yǎng)液20 ml、起始pH值5.0,28℃固體發(fā)酵3.5 d。在此優(yōu)化條件下,纖維素酶活力可達0.34 IU/ml[19]。巫小丹等采用PDA-愈創(chuàng)木酚法篩選到1株綠色木霉(Trichoder?ma viride)，在其研究的最佳產(chǎn)酶發(fā)酵條件下，CMCase、FPA和β-葡糖苷酶酶活力分別達(2.73±0.08)、(0.95±0.09)、(1.75±0.12)IU/ml[20]。經(jīng)過對比，本試驗篩選到的青霉、黑曲霉、綠色木霉的酶活性比上述研究的酶活性要低，可能是因為發(fā)酵體系的成分、體系中所含的誘導物及發(fā)酵條件導致。

3.2 不同真菌組合固態(tài)發(fā)酵降解玉米秸稈的效果

與木質(zhì)素降解相關(guān)的降解酶主要是Lip、Mnp、Laccase。產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的菌種主要是一些真菌類，其中，白腐菌是目前所發(fā)現(xiàn)的一類唯一能夠徹底降解木質(zhì)素的微生物，它可以分泌木質(zhì)素過氧化物酶（Lip）、錳過氧化物酶（Mnp）、漆酶（Lac）等胞外酶降解木質(zhì)素。黃孢原毛平革菌是白腐菌的典型代表。其分泌的木質(zhì)素降解酶主要為Lip、Mnp,不產(chǎn)Lac。與此同時，在不同的研究中發(fā)現(xiàn)，青霉、黑曲霉、綠色木霉也能分泌木質(zhì)素降解酶。尹璐對簡青霉降解稻草秸稈的研究發(fā)現(xiàn)，簡青霉對稻草秸稈降解的大致過程是先對表面蠟質(zhì)和纖維素、半纖維素進行降解，對木質(zhì)素進行側(cè)鏈氧化和甲基化；然后木質(zhì)素中的苯環(huán)被解鏈，并得到進一步降解[21]。郁紅艷等研究發(fā)現(xiàn)，其降解主要發(fā)生在Lip與木聚糖酶酶活高產(chǎn)的初級代謝階段，與白腐真菌次級代謝開始降解木質(zhì)素的作用機制不同，25 d培養(yǎng)可使稻草木質(zhì)素絕對量損失0.23 g，降解率達14.94%[22]。刁興梅等從農(nóng)林廢物堆肥中分離得到1株黑曲霉,具有木質(zhì)素降解能力,兼具低分子量木質(zhì)素酚型、非酚型類物質(zhì)的降解能力。在試驗條件下,培養(yǎng)30 d使木質(zhì)素降解率達16.87%,紅外光譜分析結(jié)果表明,稻草木質(zhì)素結(jié)構(gòu)被破壞,木質(zhì)素各官能團的降解作用不同[23]。因此，將黃孢原毛平革菌和青霉真菌等進行組合，可以將初級代謝階段和次級代謝階段開始的降解活動進行復合，充分利用各種酶活，增加其降解秸稈的效果。

本試驗中，由計算可知，黃孢原毛平革菌純培養(yǎng)降解玉米秸稈，木質(zhì)素降解率為29.10%，低于蘆淞等的研究結(jié)果[24]。蘇瑞等研究發(fā)現(xiàn)，黃孢原毛平革菌降解稻草,木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的降解量分別提高了3.285%、0.304%和2.123%[25]。王麗婷等對大豆秸稈中木質(zhì)纖維素進行降解，F(xiàn)T?IR檢測后發(fā)現(xiàn)，與木質(zhì)素相關(guān)的譜峰(1 099 cm-1、1 057～1 038 cm-1)相對強度減小,與苯環(huán)相關(guān)的譜峰(1 643～1 608 cm-1、1 510～1 508 cm-1)相對強度增加,表明部分大分子木質(zhì)素裂解成小分子木質(zhì)素或木質(zhì)素單體,對比其他譜峰相對強度的變化發(fā)現(xiàn),木質(zhì)素中苯環(huán)等環(huán)狀化合物含量減少[26]。

黑曲霉降解稻草時，降解率最高可達6.20%[27]，明顯低于本試驗的纖維素降解率9.32%。王儀明等利用綠色木霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵小麥秸稈后，中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、纖維素含量和半纖維素含量比發(fā)酵前分別下降5.22%、6.88%、4.73%和4.16%,木質(zhì)素含量無明顯變化[28]，其降解率明顯低于本試驗的結(jié)果，主要是因為本試驗的試驗材料是玉米秸稈，比小麥秸、稻草秸營養(yǎng)價值高，易于降解。

任克寧等利用白腐菌5.776和黑曲霉3.3148分解玉米秸稈，白腐菌液體菌種和黑曲霉孢子懸浮液的接種比例為5∶1,白腐菌接種2 d后再接入黑曲霉孢子懸浮液,發(fā)酵10 d,所得產(chǎn)物中性洗滌纖維的含量為52.07%[29]。比本試驗的白腐菌和黑曲霉組合的中性洗滌纖維含量60.23%要低，可能是所用的玉米秸稈本身的木質(zhì)纖維素的含量及硅酸鹽的含量不同，導致該真菌組合對玉米秸稈的降解率不高。陳耀寧報道，黃孢原毛平革菌和歧皺青霉混合培養(yǎng)發(fā)酵稻草秸后，發(fā)酵體系內(nèi)的微生物產(chǎn)酶更加穩(wěn)定，峰值維持時間較長，發(fā)酵結(jié)束時Lip還處于較高水平(52 IU/ml)，約是黃孢純培養(yǎng)時的兩倍，結(jié)束時Mnp也比其他純培養(yǎng)的高。同時，半纖維素、纖維素和木質(zhì)素降解率均比純培養(yǎng)時高，分別為53.1%、52.7%和54.9%[30]，均高于本試驗的半纖維素、纖維素和木質(zhì)素降解率。

本試驗將黃孢原毛平革菌分別與上述篩選的纖維素分解菌進行組合，測定其在固態(tài)發(fā)酵條件下的酶活及其降解秸稈的效果。對表5進行分析，PC+黑曲霉+青霉+木霉的木質(zhì)素含量低于PC、黑曲霉、青霉的純培養(yǎng)發(fā)酵，與木霉發(fā)酵降解秸稈的木質(zhì)素含量相差不多；同時表明不同的纖維素降解菌和木質(zhì)素降解菌簡單的組合在一起，往往達不到滿意的效果，有的組合降解秸稈的效果并不明顯。經(jīng)過比較，PC+黑曲霉+青霉+木霉是比較理想的組合，Mnp的酶活達到449.58 U/ml,Lip的酶活為5.12 U/ml，纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率為29.60%、12.02%、29.10%。

4 結(jié)論

本試驗得到了一種能較好降解纖維素和木質(zhì)素的菌株的組合PC+黑曲霉+青霉+木霉,纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率分別為29.60%、12.02%、29.10%。