許 英，陳友華（.江蘇省泰州市中醫(yī)院檢驗科 5300；.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科 009）

曲霉菌廣泛存在于自然環(huán)境中，大部分為條件致病菌。以往認為只引起外源性感染，如眼角膜炎、皮膚感染等。但近年來，隨著抗腫瘤藥物、免疫抑制劑和器官移植等治療的廣泛開展，以及在危重患者中廣譜抗生素的長期使用，侵襲性真菌感染（invasive fungal disease，IFD）的發(fā)病率逐年上升［1］。隨著氟康唑在高危人群中廣泛預防性使用，白色念珠菌感染有所減少，而非念珠菌及曲霉菌的感染有所增加［2－3］。臨床上由于侵襲性曲霉菌病的增加，如何正確地診斷和準確檢測曲霉菌感染的病原體已十分重要。本文根據(jù)本院微生物室的條件，開展了一些曲霉菌感染的實驗室檢查方法，以協(xié)助臨床診斷IPA，為臨床抗感染治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標本來源 2011年1～12月本院32例胸部CT檢查有陰影、經(jīng)抗生素治療無效的臨床疑似肺曲霉菌病的患者，留取其痰液或肺泡灌洗液標本作培養(yǎng)，或者抽取其靜脈血標本進行血清1，3－β－D葡聚糖檢測（簡稱G試驗）和半乳甘露聚糖抗原檢測（簡稱GM試驗），另外，肺泡灌洗液也可以作G試驗和GM試驗。

1.2 方法

1.2.1 沙保羅平皿培養(yǎng) 將痰液或肺泡灌洗液標本接種在沙保羅平皿上，放35℃恒溫孵箱24～48h后觀察平皿上菌落生長的顏色和形態(tài)，初步判斷是否為曲霉菌。

1.2.2 直接涂片鏡檢 取少量沙保羅平皿上疑似曲霉菌的菌落置潔凈玻片，經(jīng)棉藍染色后鏡檢，如在鏡下見到分隔、呈45°角分支的菌絲，即可判斷為曲霉菌。

1.2.3 血清和肺泡灌洗液檢測GM試驗和G試驗 GM試驗是檢測曲霉菌生長過程中向血液中所釋放的細胞壁成分半乳甘露聚糖（galactoman－nan GM），由于側鏈上的呋喃半乳糖具有抗原性，因而可以通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法進行檢測。G試驗又稱為1，3－β－D葡聚糖試驗，可用于系統(tǒng)性真菌病的診斷篩查，但是因為1，3－β－D葡聚糖是除隱球菌、結核菌外所有酵母菌及絲狀真菌的細胞壁的特有成分，也包括曲霉菌，所以其檢測陽性只能提示深部真菌感染的存在，無法用于具體種屬的鑒定。其檢測原理是通過1，3－β－D葡聚糖肽鏈葡萄糖殘基抗原與馬蹄鱟（東方鱟和美洲鱟）凝血系統(tǒng)中的凝血酶原G因子結合，經(jīng)凝血酶原級聯(lián)反應，形成凝固蛋白，采用比濁法對葡聚糖濃度進行定量檢測。

1.2.4 分子生物診斷技術 在有條件的情況下，使用聚合酶鏈反應（PCR）診斷技術將在侵襲性曲霉菌感染中起到重要作用。

2 結 果

32例胸部CT有陰影、抗菌藥物治療無效的患者，痰液或肺泡灌洗液標本作真菌培養(yǎng)后，均有絲狀真菌生長，經(jīng)鑒定均為曲霉菌。同時對32例患者作GM試驗和G試驗，結果顯示：GM試驗檢測值有27例高于正常值（＞0.5），其中在0.5～0.7之間有5例，0.7～1.0之間有7例，1.0～1.5之間有10例，1.5～2.0之間有5例，說明GM試驗特異性高。而G試驗檢測則有29例檢測值高于正常值，說明G試驗敏感度高，提示有深部真菌感染的存在，但不能判斷是否為曲霉菌。由于本實驗標本數(shù)較少，故不能全面說明兩種試驗的特異度和敏感度。

3 討 論

曲霉菌是以枯死植物、動物排泄物及動物尸體為營養(yǎng)源的一種寄生于土壤中的腐生菌，是典型的絲狀菌，占空氣中真菌的12%左右。其形態(tài)特征是在分生孢子的頭部有一個頂囊，以煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉等為代表。各個菌種形成的菌落顏色及頂囊形狀均不一樣，可用于菌種的鑒別。由于曲霉菌的孢子主要通過吸入從呼吸道侵入患者體內(nèi)，因此，曲霉菌感染部位主要集中在肺部，從而引起肺部侵襲性曲霉（invasive pulmonary aspergillosis，IPA）。這一點，從分離到曲霉菌的臨床標本僅為痰液及肺泡灌洗液就可以證明。診斷曲霉菌在肺部是定植還是侵襲性生長，關鍵在于其是否合成GM。如果痰液或肺泡灌洗液標本培養(yǎng)到曲霉菌且GM試驗檢測結果為陽性，即可診斷為曲霉菌侵襲性感染。由于曲霉菌廣泛存在于周圍環(huán)境中，所以送檢標本容易受到污染。本室采用多份標本送檢和多個平皿接種。如果多份標本、多個沙保羅培養(yǎng)皿均有曲霉菌生長，則標本受到污染的可能性小。當然，與臨床科室的聯(lián)系也是尤為重要的，了解患者是否有肺感染史以及抗生素治療是否有效，患者肺部CT上是否出現(xiàn)大結節(jié)影伴有周圍出血的征象（即暈輪征），同時可建議患者進行GM試驗和G試驗檢測，以協(xié)助臨床醫(yī)師明確診斷。

GM試驗?？稍诨颊吲R床癥狀出現(xiàn)前5～8d獲得陽性結果［2］，并可對血清、腦脊液、肺泡或支氣管灌洗液進行檢測，因而往往可以使診斷提前。有文獻報道GM試驗對于IPA診斷的特異度和敏感度分別達89%和71%［3－4］。有試驗表明肺泡灌洗液中半乳甘露聚糖指數(shù)比血清測定更準確，敏感度和特異度均在90%以上［5］，所以GM試驗是診斷侵襲性曲霉感染的微生物檢查證據(jù)之一，通過監(jiān)測GM值也可以作為治療效果的參考指標之一。但是GM試驗也含有假陽性因素［6］：如同時應用哌拉西林／他唑巴坦等抗生素，患者預處理或放化療后胃黏膜屏障受損食物中的GM成分入血等。

但G試驗對于IPA的早期診斷有局限性，檢測結果陽性只能提示有深部真菌感染的存在，無法表明是何種真菌感染，判定為IFA。其次某些物質中存在1，3－β－D葡聚糖類似物，可造成假陽性結果，如中空纖維濾膜、腎透析儀的洗滌液，紗布等的污染，真菌為原料制成的抗生素，食物中的1，3－β－D葡聚糖通過受損胃腸黏膜入血等情況。另外，G試驗檢測是采用比濁法，故對血清標本要求高，如黃疸、溶血、脂血等情況都會對檢測結果造成影響。

總之，IPA診斷是個難題，需要結合臨床癥狀、胸部CT、用藥情況及實驗室檢查等綜合判斷。隨著惡性腫瘤、血液病及免疫功能低下患者數(shù)量的增多，真菌感染乃至曲霉菌感染病例逐漸增多，如何準確診斷是否為侵襲性曲霉菌病是重要的問題。根據(jù)本室條件，建立以上幾種檢測侵襲性曲霉菌的方法，比較之下，培養(yǎng)方法及形態(tài)學檢查是主要的，仍然是經(jīng)典方法。而近年來GM試驗和G試驗成為曲霉菌感染的實驗室檢查中的非常重要的兩種抗原［7］，而幾種方法聯(lián)合檢測會大大提高IPA的確診率［8］，這一點值得實驗室人員密切關注。

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