肖啟國(guó)（湖南省衡陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 421001）

流感嗜血桿菌（Hi）是呼吸道感染的常見病原菌之一，常引起小兒肺炎、老年人繼發(fā)性感染、化膿性腦膜炎、肺膿腫、亞急性心內(nèi)膜炎、敗血癥等侵襲性感染。近年來，細(xì)菌耐藥性的問題已經(jīng)引起全球醫(yī)藥界的共同關(guān)注，如何防止耐藥菌的產(chǎn)生以及控制耐藥菌的擴(kuò)散與流行成為研究的焦點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外的大量文獻(xiàn)報(bào)道表明［1－6］，隨著嗜血桿菌專用分離培養(yǎng)基的應(yīng)用，使得嗜血桿菌的分離率有了很大的提高，為臨床診斷疾病提供了依據(jù)。然而，由于抗菌藥物的濫用，嗜血桿菌的耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，并且耐藥率正以較快速度上升，給臨床治療嗜血桿菌感染性疾病帶來較大困難。國(guó)內(nèi)許多地區(qū)如浙江、深圳、上海、北京等的研究報(bào)道都顯示［7－12］，嗜血桿菌對(duì)以往首選的治療藥物如氨芐西林、第1代頭孢菌素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明等產(chǎn)生嚴(yán)重耐藥，而產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶是嗜血桿菌的主要耐藥機(jī)制。為了解本院嗜血桿菌的耐藥性，指導(dǎo)臨床合理用藥，作者對(duì)2010年10月至2011年11月本院住院患者607份標(biāo)本（痰、咽拭子、支氣管分泌物）進(jìn)行檢測(cè)，共分離到136株嗜血桿菌，并對(duì)其進(jìn)行了β－內(nèi)酰胺酶的測(cè)定和10種抗菌藥物耐藥性分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 用一次性無菌痰杯及無菌試管收集本院2010年10月至2011年11月各科室呼吸道感染住院患者的痰標(biāo)本、咽拭子以及用纖維支氣管鏡取出的支氣管分泌物，患者年齡為6個(gè)月至85歲。

1.2 儀器與試劑 細(xì)菌培養(yǎng)箱，生物安全柜，He選擇培養(yǎng)基，M－H瓊脂平板，血平板，中國(guó)藍(lán)平板，痰消化液（1%胰酶溶液，pH 7.6），10種抗菌藥物藥敏紙片（青霉素、壯觀霉素、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢呋肟、氧氟沙星、洛美沙星、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素均為OXOID公司產(chǎn)品），棉拭子，試管，一次性痰杯，頭孢硝基噻吩紙片（OXOID公司產(chǎn)品）。

1.3 方法

1.3.1 痰標(biāo)本的預(yù)處理 在痰標(biāo)本中加入等量的消化液，置37℃溫箱，將痰液消化10min。

1.3.2 痰培養(yǎng) 將咽拭子及處理后的痰標(biāo)本接種于He選擇培養(yǎng)基、血平板及中國(guó)藍(lán)平板，置于35℃培養(yǎng)箱孵育18～24 h，He選擇培養(yǎng)基需置于5%CO2溫箱培養(yǎng)。

1.3.3 鏡檢 取無色透明或半透明、濕潤(rùn)、扁平、邊緣整齊的菌落涂片，革蘭染色，鏡檢為革蘭陰性短小桿菌。

1.3.4 純培養(yǎng) 取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.3.5 鑒定 衛(wèi)星試驗(yàn)。

原理：流感嗜血桿菌生長(zhǎng)需要Ⅹ因子和Ⅴ因子，副流感嗜血桿菌只需要Ⅴ因子，血平板本身含有Ⅹ因子，Ⅴ因子處于抑制狀態(tài)，而金黃色葡萄球菌能合成較多的Ⅴ因子，所以兩菌共同培養(yǎng)于血平板上時(shí)，金黃色葡萄球菌可以促進(jìn)流感嗜血桿菌的生長(zhǎng)。

方法：將待測(cè)菌分別密集劃線接種于血平板和M－H平板，再將金黃色葡萄球菌與嗜血桿菌作垂直劃線置于5%CO2溫箱，35℃孵育18～24h后觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷：在金黃色葡萄球菌附近的嗜血桿菌菌落較大，較遠(yuǎn)處菌落較小甚至無菌生長(zhǎng)，若只在血平板上衛(wèi)星試驗(yàn)陽性的則為流感嗜血桿菌，在血平板和M－H平板上衛(wèi)星試驗(yàn)均陽性為副流感嗜血桿菌。

1.3.6 藥敏試驗(yàn) 用瓊脂紙片擴(kuò)散（K－B）法檢測(cè)嗜血桿菌對(duì)青霉素、壯觀霉素、頭孢噻肟、頭孢曲松等10種抗菌藥物的耐藥性。全部試驗(yàn)過程用Hi標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC49247進(jìn)行質(zhì)控。用精確度為1的游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑，參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果確定藥物敏感性。

1.3.7 β－內(nèi)酰胺酶的測(cè)定 原理及方法：頭孢硝基噻吩顯色反應(yīng)法。用接種環(huán)挑取待測(cè)菌株于商品化頭孢硝基噻吩濾紙片上，于10min內(nèi)由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色即為陽性結(jié)果，提示產(chǎn)色頭孢菌素β－內(nèi)酰胺環(huán)被酶打開。

2 結(jié) 果

2.1 嗜血桿菌的分離率 從607例痰及咽拭子標(biāo)本中分離到136株嗜血桿菌，分離率為22.4%，其中流感嗜血桿菌31株，分離率為5.1%，副流感嗜血桿菌為105株，分離率為17.3%，嗜血桿菌的分離率以呼吸內(nèi)科（9.7%）最高，其次為心內(nèi)科（2.8%）和兒科（2.6%），各科室嗜血桿菌的分離率詳情見表1。

2.2 136株嗜血桿菌藥敏結(jié)果 見表2。

2.3 β－內(nèi)酰胺酶檢測(cè)的結(jié)果 136株嗜血桿菌中32株β－內(nèi)酰胺酶陽性，產(chǎn)酶率為23.5%。

3 討 論

嗜血桿菌主要寄居于人類上呼吸道黏膜，在呼吸道感染中占有極為重要的地位。嗜血桿菌常引起下呼吸道感染、肺炎、鼻炎、咽炎、亞急性心內(nèi)膜炎等嚴(yán)重疾病，特別是流感嗜血桿菌致病性最強(qiáng)，其所致疾病分為兩類：即原發(fā)感染和繼發(fā)感染，前者主要屬于外源性感染，通過呼吸道傳播，常見于兒童，后者主要由寄居于上呼吸道的無莢膜菌株所致，多見于老人，兩類感染均可引起呼吸道本身的疾病，也可引起其他部位感染，如菌血癥、腦膜炎、膿毒癥等。

Hi是兒童急性呼吸道感染重要的細(xì)菌性病原。Pechere［13］指出：在發(fā)展中國(guó)家細(xì)菌性肺炎較單純病毒性肺炎常見。最近幾年引起兒童呼吸道感染、鼻竇炎、角膜炎都有上升趨勢(shì)，Tamargo等［14］1990～2002年對(duì)938株Hi的耐藥性研究認(rèn)為Hi對(duì)氨芐西林耐藥呈上升趨勢(shì)，為40.7%～54.8%。1999年的SENTRY抗菌藥物耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示：對(duì)氨芐西林耐藥菌株最低抑菌濃度（MIC）≥4μg／mL在美國(guó)為31.5%，加拿大27.0%，亞太地區(qū)16%～20%，拉丁美洲12.5%，歐洲11.8%［15］。氨芐西林是治療Hi感染的首選藥。本組青霉素耐藥率高達(dá)90.4%，明顯高于國(guó)內(nèi)以往報(bào)道以及歐洲、北美、東南亞等一些國(guó)家和地區(qū)的報(bào)道。

近幾年，世界各地耐氨芐西林的Hi發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，在北美20.0%～40.0%的Hi對(duì)氨芐西林耐藥，中國(guó)不同城市或地區(qū)耐藥率也在4.0%～33.0%不等［16］。據(jù)報(bào)道，美國(guó) Hi產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶陽性率為34.5%、法國(guó)29.3%、英國(guó)21.2%、中國(guó)香港20.2%、中國(guó)不同地區(qū)Hi產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶陽性率有一定差別，在15.4%～23.0%不等。耐藥菌株中，以β－內(nèi)酰胺酶陽性為主，說明產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶是Hi的主要耐藥機(jī)制。早在1988年Gutmawn等［17］提出Hi對(duì)氨芐西林、阿莫西林的耐藥主要機(jī)制是產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶，以質(zhì)粒介導(dǎo)的TEM－1型酶為主，很少是ROB型。

隨著新技術(shù)、新療法的開展，各種精密儀器的采用，介入性檢查與治療的不斷增多，使院內(nèi)感染不斷增加。為了把院內(nèi)感染的發(fā)病率降至最低水平，醫(yī)護(hù)人員必須樹立高度的責(zé)任心，加強(qiáng)無菌觀念，重視對(duì)病區(qū)環(huán)境清潔、消毒工作及醫(yī)療用具的滅菌消毒和對(duì)患者的保護(hù)性措施。同時(shí)，在醫(yī)護(hù)人員和患者之間加強(qiáng)醫(yī)院感染知識(shí)的教育和普及，提高醫(yī)院內(nèi)各方面人員對(duì)醫(yī)院感染的認(rèn)識(shí)，盡可能適應(yīng)控制和降低醫(yī)院感染率的要求。嗜血桿菌的抗菌藥物耐藥性已越來越引起人們的重視。本文對(duì)136株嗜血桿菌進(jìn)行β－內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)，有23.5%的陽性率，與國(guó)外有關(guān)嗜血桿菌β－內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生率34%～36%的報(bào)道相近［18－19］。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，青霉素、頭孢呋肟、洛美沙星的耐藥率分別是90.4%、22.1%、68.4%，必須引起臨床的重視。抗菌藥物的廣泛應(yīng)用是造成細(xì)菌耐藥的重要原因，臨床要注意新耐藥菌株可能引起的繼發(fā)感染，正確合理使用抗菌藥物，盡可能減少抗菌藥物的應(yīng)用，減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。

本實(shí)驗(yàn)采用He選擇培養(yǎng)基，極大提高了分離率，本組實(shí)驗(yàn)嗜血桿菌的檢出率為22.4%，其中以副流感嗜血桿菌為主，占17.3%，表明本院嗜血桿菌感染以副流感嗜血桿菌為主。同時(shí)在各科室中以呼吸內(nèi)科、兒科、心內(nèi)科的檢出率居前三位，分別為9.7%、2.6%、2.8%，表明本院嗜血桿菌主要引起呼吸系統(tǒng)疾病，其中以老年人和小兒多見，而亞急性心內(nèi)膜炎以老年人多見，常由繼發(fā)性感染引起，應(yīng)引起臨床醫(yī)生的重視。嗜血桿菌耐藥性監(jiān)測(cè)對(duì)于臨床呼吸道感染和繼發(fā)其他部位感染性疾病的治療非常重要，長(zhǎng)期以來，嗜血桿菌感染以氨芐青霉素、頭孢呋肟、洛美沙星等作為首選藥物，但近年來，由于抗菌藥物的濫用，產(chǎn)生了極大的耐藥性，本組實(shí)驗(yàn)中，青霉素、頭孢呋肟、洛美沙星的耐藥率分別是90.4%、22.1%、68.4%。表明此3種藥物已不適用為首選，產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶是嗜血桿菌耐藥的主要機(jī)制，主要是由質(zhì)粒介導(dǎo)的TEM－1型或其他少見的ROB－1型的β－內(nèi)酰胺酶引起。另外還有由染色體介導(dǎo)的青霉素結(jié)合蛋白的改變和細(xì)胞膜對(duì)抗菌藥物通透性的改變引起，本院結(jié)果顯示，產(chǎn)酶率有上升的趨勢(shì)，所檢出的136株嗜血桿菌中有32株β－內(nèi)酰胺酶陽性，產(chǎn)酶率23.5%，β－內(nèi)酰胺酶陽性可預(yù)測(cè)該菌對(duì)青霉素、氨芐西林、阿莫西林耐藥。本院嗜血桿菌對(duì)頭孢曲松、壯觀霉素的敏感率為100%，同時(shí)對(duì)頭孢噻肟、強(qiáng)力霉素的耐藥率也較低，因此，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果建議臨床治療嗜血桿菌感染性疾病應(yīng)以頭孢曲松和壯觀霉素為首選藥物，同時(shí)配以頭孢噻肟和強(qiáng)力霉素進(jìn)行治療。

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