房巖強 魏益民 張 波

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點實驗室，北京 100193）

蛋白質(zhì)的螺桿擠壓過程通常被認(rèn)為是蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果［1］。在機械能和熱能的作用下，蛋白質(zhì)分子維持高級結(jié)構(gòu)的非共價鍵被破壞，分子逐漸展開呈鏈狀結(jié)構(gòu)，并順著物料運動方向取向［1－3］。在取向過程中，蛋白質(zhì)分子與蛋白質(zhì)分子或其他分子之間再隨機發(fā)生各種化學(xué)作用?；瘜W(xué)作用主要可能發(fā)生在分子側(cè)鏈之間，其結(jié)果是形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并呈現(xiàn)出各向異性，即在平行于運動方向的強度較大，而垂直于運動方向的強度較弱［4－6］。由于體系中蛋白質(zhì)分子較多，因此蛋白質(zhì)分子間作用形成的聚合體可能是骨架，其他分子則填充在骨架之間［7］。

研究和明確螺桿擠壓過程中蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的變化，可為控制擠壓過程中蛋白質(zhì)的變性提供理論依據(jù)，從而有利于改進(jìn)擠壓組織化蛋白產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝和提高產(chǎn)品質(zhì)量。另外，通過擠壓過程中蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變化的研究對于闡明擠壓組織化蛋白產(chǎn)品的形成機理具有指導(dǎo)意義。本文從蛋白質(zhì)組分、分子質(zhì)量、共價鍵以及二級結(jié)構(gòu)等方面總結(jié)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在螺桿擠壓過程中的變化。

1 蛋白質(zhì)的組分及分子質(zhì)量的變化

植物蛋白，如大豆蛋白、小麥蛋白、花生蛋白等是擠壓組織化蛋白生產(chǎn)的主要原料。植物蛋白依據(jù)其溶解性，可分為清蛋白（albumin）、球蛋白（globulin）、醇溶蛋白（prolamin）、谷蛋白（glutenin）和殘渣蛋白（residue）［8］。擠壓過程中，蛋白質(zhì)分子變性，溶解性等理化特性發(fā)生變化，表現(xiàn)出蛋白質(zhì)組分比例的變化。對于擠壓后蛋白質(zhì)組分及分子質(zhì)量的變化，研究者一方面比較關(guān)注擠出蛋白的組分及分子質(zhì)量分布；另一方面，研究者比較關(guān)注的是不同蛋白質(zhì)組分與擠壓產(chǎn)品網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成的關(guān)系。

不同擠壓原料，5種蛋白質(zhì)組分含量有所不同，如小麥蛋白主要以谷蛋白和醇溶蛋白為主，而大豆蛋白主要以球蛋白為主。目前，大多數(shù)研究表明，擠壓后，原料中的主要蛋白質(zhì)組分含量顯著降低，而殘渣蛋白含量顯著增加。Gujska等［9］采用Osborne的蛋白質(zhì)組分提取方法，對不同溫度（110、135、150℃）擠壓后的菜豆和斑豆中的清蛋白和球蛋白含量進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，各種溫度擠壓處理后，菜豆和斑豆中的清蛋白和球蛋白含量都顯著降低，而殘渣蛋白含量均顯著增加。擠壓后菜豆中的清蛋白和球蛋白分別降低了59%～84%和70%～93%，而殘渣蛋白增加了221%～288%。斑豆中的清蛋白和球蛋白分別降低了77%～80%和92%～94%，而殘渣蛋白增加了253%～264%。Alonso等［10］對擠壓前后豌豆和四季豆中清蛋白和球蛋白的含量進(jìn)行了類似研究，結(jié)果表明，擠壓后豌豆中的清蛋白和球蛋白分別降低了41%和78%，而殘渣蛋白增加了226%。四季豆中的清蛋白和球蛋白分別降低了64%和85%，而殘渣蛋白增加了224%。Li等［11］通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）對小麥蛋白擠壓前后的組分分布進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，擠壓后麥谷蛋白和麥醇溶蛋白含量顯著降低，殘渣蛋白顯著增加。

擠壓過程中，蛋白質(zhì)組分的變化與不同組分氨基酸的組成有較為密切的關(guān)系。清蛋白和球蛋白大多是生理活性蛋白質(zhì)，含較多的賴氨酸、色氨酸和蛋氨酸；醇溶性蛋白和谷蛋白是貯藏性蛋白，脯氨酸和谷氨酰胺含量較高，賴氨酸、色氨酸和蛋氨酸含量較低。Li等［11］發(fā)現(xiàn)，小麥蛋白擠壓過程中，分子質(zhì)量位于45～66 ku的麥醇溶蛋白受高溫擠壓影響較小，認(rèn)為可能是由于這部分麥醇溶蛋白所含疏水性氨基酸或半胱氨酸較少，擠壓過程中，它們不能通過疏水作用或二硫鍵發(fā)生聚合。Fischer［12］對小麥蛋白擠出物研究后也有類似發(fā)現(xiàn)。Fischer的結(jié)果表明，麥醇溶蛋白與蛋白質(zhì)網(wǎng)的形成高度相關(guān)，但不同種類麥醇溶蛋白與其的密切程度不同。擠壓產(chǎn)品網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成主要與α－麥醇溶蛋白和γ－麥醇溶蛋白有關(guān)，與ω－麥醇溶蛋白關(guān)系較小。這是由于ω－麥醇溶蛋白缺少巰基基團(tuán)，不能通過二硫鍵發(fā)生聚合。但Fischer又認(rèn)為ω－麥醇溶蛋白仍可能通過非二硫鍵的聚合對蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)形成發(fā)揮一定作用。

螺桿擠壓過程中，分子質(zhì)量變化是導(dǎo)致蛋白質(zhì)理化特性改變的重要原因，例如分子質(zhì)量或分子尺寸的增加往往導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解性的降低［11］。擠壓過程中既有蛋白質(zhì)的降解，又有蛋白質(zhì)的聚合［12－14］，因此，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的變化較為復(fù)雜。對于擠壓過程中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量變化的研究，目前多采用聚丙烯酰胺凝膠（SDS－PAGE）電泳法，考察蛋白質(zhì)亞基分子質(zhì)量分布的變化。對于蛋白質(zhì)真實分子質(zhì)量變化的研究還很有限［15］。

Alonso等［10］通過 SDS－PAGE對豌豆和腰豆擠壓前后的蛋白質(zhì)片段進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，擠壓后，豌豆原有的 75、50、38、25、22 ku的電泳條帶變得模糊，而新出現(xiàn)了34、14 ku的蛋白片段；腰豆原有的45、31 ku的電泳條帶消失，新生成了分子質(zhì)量為14～22 ku的蛋白片段［6］。Chiang［16］通過 SDS－PAGE對大豆擠壓前后的蛋白質(zhì)片段進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，擠壓后大豆原有的42 ku的7S球蛋白亞基消失，而34～44 ku11S球蛋白亞基的含量顯著增加。陳鋒亮［17］對大豆蛋白擠出物的亞基條帶分析后，發(fā)現(xiàn)大豆蛋白 7S／11S的亞基比例顯著降低。Anderson等［13］通過SDS－PAGE對小麥蛋白擠壓前后的蛋白質(zhì)片段進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，擠壓后蛋白質(zhì)的亞基分布呈現(xiàn)出由高分子質(zhì)量向低分子質(zhì)量轉(zhuǎn)變的趨勢。徐樹來［18］通過SDS－PAGE對米糠蛋白擠壓前后的蛋白質(zhì)片段進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，擠壓后米糠蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量整體降低。

擠壓后，原料中的主要蛋白質(zhì)組分含量顯著降低，殘渣蛋白含量顯著增加。但擠壓處理對ω－麥醇溶蛋白等不含硫氨基酸片段影響較小。擠壓后，蛋白質(zhì)的亞基分子質(zhì)量分布呈現(xiàn)出向小分子質(zhì)量轉(zhuǎn)變的趨勢，這可能是由于蛋白質(zhì)分子受到高溫和剪切力的作用后，各亞基產(chǎn)生分離引起的［19］。

2 蛋白質(zhì)共價鍵的變化

螺桿擠壓破壞了蛋白質(zhì)分子與蛋白質(zhì)分子或其他分子之間舊的化學(xué)鍵和相互作用，并通過形成新的化學(xué)交聯(lián)，使得肉類似物得以形成。肽鍵和二硫鍵是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)維持中的主要共價鍵。它們也是擠壓過程中蛋白質(zhì)分子作用力變化的重要研究對象。

擠壓過程中是否有異肽鍵的形成，即維持?jǐn)D壓產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的作用力中是否有異肽鍵一直是研究者爭議的焦點。Burgess等［20］認(rèn)為，擠壓過程中，大豆蛋白分子間有新的肽鍵（異肽鍵）形成，新形成的異肽鍵是維持?jǐn)D壓產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的最主要化學(xué)鍵，而二硫鍵的作用可以忽略。Hager［21］以大豆?jié)饪s蛋白為原料，對維持組織化產(chǎn)品化學(xué)作用力的主要類型進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，擠壓過程中沒有異肽鍵的生成，疏水作用、氫鍵和分子間二硫鍵是維持?jǐn)D壓產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的三種主要化學(xué)作用。這與Burgess等的結(jié)論截然相反。Hager認(rèn)為，這可能是由于擠壓溫度不同所致。Burgess等采用的擠壓溫度為150～190℃，而Hager采用的最高溫度僅有150℃。后來，Prudêncio－Ferreira等［22］系統(tǒng)研究了擠壓溫度（140～180℃）對蛋白質(zhì)分子作用力的影響。結(jié)果表明，二硫鍵和非共價鍵作用是維持?jǐn)D壓產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的主要作用力，即使180℃條件下擠壓后，維持組織化產(chǎn)品的作用力中也沒有異肽鍵。當(dāng)前大多數(shù)研究表明，組織化產(chǎn)品網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的維持主要通過二硫鍵和非共價鍵作用，而沒有異肽鍵的參與［23－26］。

自由巰基和二硫鍵含量變化的研究是探討二硫鍵作用的重要途徑。Burgess等［20］對大豆?jié)饪s蛋白擠壓前后自由巰基和二硫鍵含量測定后發(fā)現(xiàn)，擠壓后大豆蛋白的二硫鍵濃度由4．5×10－8mol／mg降至0．9×10－8mol／mg，而自由巰基濃度由 3．3×10－8mol／mg升高到 48．9×10－8mol／mg。因此，他們認(rèn)為擠壓會嚴(yán)重破壞二硫鍵的形成。Hager［21］在水分為27%擠壓溫度140℃條件下考察了擠壓對大豆分離蛋白自由巰基和二硫鍵含量的影響。結(jié)果表明，擠壓后大豆蛋白的二硫鍵濃度由22．7×10－8mol／mg降至19．6×10－8mol／mg，而自由巰基濃度由 0．5×10－8mol／mg升高到4．1×10－8mol／mg。當(dāng)前，大部分研究結(jié)果與他們的研究基本一致。即擠壓處理對二硫鍵有破壞作用，并引起自由巰基含量的增加［11，13，22］。

擠壓溫度是影響蛋白質(zhì)自由巰基和二硫鍵含量的重要因素［22，27－28］。Prudêncio－Ferreira等［22］分別對140、160、180℃擠壓處理后大豆分離蛋白擠出物中自由巰基和二硫鍵的含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，140℃擠出物中的二硫鍵含量與原料相比基本沒有變化（增加了0．2%），160、180℃擠出物中二硫鍵的含量相比原料分別降低了17%和25%；自由巰基含量在各溫度處理后相比原料都有顯著增加，分別增加了42%、76%和 122%。Fischer［12］分別對 140、160、180℃擠壓處理后小麥蛋白擠出物中自由巰基的含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，自由巰基含量在各溫度處理后都有顯著增加，分別增加了107%、113%和348%。Rebello等［29］分別對160、185℃小麥蛋白擠出物中的二硫鍵含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，擠壓溫度對小麥蛋白擠出物中的二硫鍵含量具有負(fù)影響。張汆［27］分別對 100、120、140、145、150、155℃擠壓處理后花生蛋白擠出物中的二硫鍵含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，當(dāng)擠壓溫度低于150℃時，擠出物中的二硫鍵含量相比原料基本沒有變化，但155℃擠壓處理后，擠出物中二硫鍵含量相比原料顯著降低?？梢姡瑪D壓溫度對二硫鍵含量具有負(fù)影響，對自由巰基含量具有正影響，特別是當(dāng)擠壓溫度大于160℃時，溫度對自由巰基和二硫鍵含量變化的影響更為明顯。

擠壓過程中，自由巰基和二硫鍵含量的變化同時受到水分含量的影響。Prudêncio－Ferreira等［22］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水分由30%升至40%時，大豆分離蛋白擠出物中自由巰基含量由 5．42×10－10mol／mg降低至4．37×10－10mol／mg，二硫鍵含量由249．9×10－10mol／mg升高至278．0×10－10mol／mg。表明水分含量對二硫鍵有正影響，對自由巰基有負(fù)影響。Fischer［12］以小麥蛋白為原料也進(jìn)行了水分含量對自由巰基含量影響的研究。結(jié)果也表明，水分含量對自由巰基有負(fù)影響。當(dāng)水分由20%升至24%時，擠出物中自由巰基含量由 11．82×10－9mol／mg降低至 4．59×10－9mol／mg。

擠壓過程中，機械剪切也是影響自由巰基和二硫鍵含量的重要因素。理論上分析，機械剪切對二硫鍵的形成具有相反的兩方面作用。一方面，機械剪切可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子更多的巰基基團(tuán)暴露；在氧氣的參與下，巰基基團(tuán)發(fā)生氧化反應(yīng)，從而促進(jìn)二硫鍵的形成。另一方面，機械剪切憑借物理剪切作用，打斷蛋白質(zhì)分子之間的二硫鍵，降低二硫鍵的含量［30－31］。因此，機械剪切對自由巰基和二硫鍵含量的影響會因機械剪切強度的不同而產(chǎn)生差異。Fischer［12］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)單位機械能耗（SME）由 32．1 Wh／kg升至41．1 Wh／kg時，小麥蛋白擠出物中自由巰基含量由 20．54×10－9mol／mg降 低 至 8．68×10－9mol／mg。Rebello等［29］發(fā)現(xiàn)，當(dāng) SME由 302 kJ／kg升至656 kJ／kg時，小麥蛋白擠出物中自由巰基含量由7．7×10－9mol／mg升高至 21．6×10－9mol／mg，而二硫鍵濃度由51．5×10－9mol／mg降低至 43．1×10－9mol／mg。

擠壓過程中沒有異肽鍵產(chǎn)生。擠壓過程中，擠壓溫度、水分含量和機械剪切強度對二硫鍵的形成都具有重要影響。擠壓溫度對二硫鍵含量具有負(fù)影響，對自由巰基含量具有正影響；當(dāng)擠壓溫度大于160℃時，自由巰基和二硫鍵含量的變化更顯著。水分含量對二硫鍵含量有正影響，對自由巰基含量有負(fù)影響。

3 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈借助氫鍵作用排列成為沿一個方向、具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，以α－螺旋、β－折疊、β－轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲最為常見［32］。擠壓過程中，蛋白質(zhì)分子去折疊化，相對線性化，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)遭到破壞。其研究焦點在于擠壓后蛋白質(zhì)的有序二級結(jié)構(gòu)是否完全喪失，即破壞的程度。

Yuryev等［33］較早通過紅外光譜技術(shù)對大豆分離蛋白擠出物構(gòu)象進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明，擠壓后，蛋白質(zhì) β－折疊結(jié)構(gòu)含量增加。Prudêncio－Ferreira等［22］對不同溫度（140、160、180℃）和水分含量（30%和40%）條件下大豆分離蛋白擠出物進(jìn)行了紅外光譜分析。結(jié)果表明，所有擠出物中都含有β－折疊結(jié)構(gòu)。魏益民等［19］以低溫脫脂豆粕為原料，分別對120、140、160℃條件下大豆蛋白擠出物的二級結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了紅外光譜分析。結(jié)果也表明，擠壓后，大豆蛋白沒有完全線性化，或完全轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，一定的有序結(jié)構(gòu)（β－折疊和β－轉(zhuǎn)角）仍被保留。但 Qi等［34］以圓二色光譜對不同溫度（50、75、100℃）和水分條件（20%～50%）下乳清分離蛋白擠出物的二級結(jié)構(gòu)研究后發(fā)現(xiàn)，50℃的擠出物與原料相比，二級結(jié)構(gòu)基本沒有變化；當(dāng)溫度升至75℃，蛋白質(zhì)有序二級結(jié)構(gòu)的含量開始顯著降低；當(dāng)溫度達(dá)100℃時，蛋白質(zhì)已只剩下無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)；表明擠壓溫度對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)影響顯著。有研究同時發(fā)現(xiàn)不同水分條件下所得擠出物的二級結(jié)構(gòu)基本沒有變化，表明水分含量對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)影響較?。?0］。陳鋒亮［17］以紅外光譜對不同擠壓溫度（140、150、160℃）和含水量（28%～60%）條件下大豆分離蛋白擠出物的二級結(jié)構(gòu)研究后也有類似發(fā)現(xiàn)，即擠壓溫度對α－螺旋和β－轉(zhuǎn)角的含量具有顯著的負(fù)影響，對β－折疊的含量具有顯著的正影響，而對無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量沒有顯著影響。物料水分對蛋白質(zhì)各二級結(jié)構(gòu)的變化影響較小。但物料水分與擠壓溫度存在顯著的交互作用，并對β－轉(zhuǎn)角的含量產(chǎn)生極顯著負(fù)影響。

擠壓過程中，機械剪切對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)也有一定影響。魏益民等［19］以低溫脫脂豆粕為原料，系統(tǒng)研究了螺桿轉(zhuǎn)速對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，當(dāng)螺桿轉(zhuǎn)速由60 r／min升高至180 r／min時，大豆蛋白β－折疊質(zhì)量分?jǐn)?shù)由55．6%降低至46．7%，而β－轉(zhuǎn)角質(zhì)量分?jǐn)?shù)由44．4%升高至53．5%。

可見，擠壓過程中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化受擠壓溫度影響較大。當(dāng)溫度高于某一臨界值時，蛋白質(zhì)的有序二級結(jié)構(gòu)開始完全喪失。此臨界值的高低因擠壓原料的不同而存在較大差異。對于植物蛋白，此臨界溫度高于180℃。水分含量對二級結(jié)構(gòu)的變化沒有顯著影響。螺桿轉(zhuǎn)速對β－折疊具有負(fù)影響，而對β－轉(zhuǎn)角具有正影響。

4 結(jié)論

螺桿擠壓后，原料中的主要蛋白質(zhì)組分含量顯著降低，殘渣蛋白含量顯著增加。擠壓后，蛋白質(zhì)亞基的分子質(zhì)量分布呈現(xiàn)出向小分子質(zhì)量轉(zhuǎn)變的趨勢。

擠壓過程中沒有異肽鍵的形成。擠壓溫度對二硫鍵含量具有負(fù)影響，對自由巰基含量具有正影響。當(dāng)擠壓溫度大于160℃時，溫度對自由巰基和二硫鍵含量的影響更明顯。水分含量對二硫鍵含量有正影響，對自由巰基含量有負(fù)影響。

擠壓會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的α－螺旋、β－轉(zhuǎn)角等有序二級結(jié)構(gòu)含量降低。當(dāng)擠壓溫度低于180℃時，植物蛋白不會完全轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。水分含量對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化沒有顯著影響。螺桿轉(zhuǎn)速對β－折疊具有負(fù)影響，對β－轉(zhuǎn)角具有正影響。

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