邢海燕 胡春萍 蔡雪婷 胡燦紅 曹 鵬 王志剛 (江蘇省中醫(yī)藥研究院,江蘇 南京 210028)
再生障礙性貧血小鼠造模方法
邢海燕 胡春萍 蔡雪婷 胡燦紅 曹 鵬 王志剛 (江蘇省中醫(yī)藥研究院,江蘇 南京 210028)
目的 探討再生障礙性貧血(AA)小鼠造模方法。方法 三次造模分別采用:免疫介導法:小鼠經6.0 Gy60Coγ射線亞致死量全身照射后,由尾靜脈輸入DBA/2小鼠的胸腺、淋巴結混合細胞懸液1×106個細胞/0.2 ml/只?;旌戏椒?小鼠一次全身3.0 Gy60Coγ射線照射后,分別在第4、5、6天腹腔注射環(huán)磷酰胺50.0 mg/kg及氯霉素62.5 mg/kg?;瘜W方法:用苯+玉米油,背部皮下注射,3次/w,共注射15次。同時腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液(50 mg/kg),每日1次共7次。結果 免疫介導法造模后模型小鼠在15 d內除1只小鼠外全部死亡;混合方法造模,模型小鼠骨髓活檢提示造模失敗;化學方法造模,造模成功,模型維持時間長。結論 免疫介導和混合方法造模速度快,對模型小鼠骨髓抑制明顯,與臨床急性AA接近;化學方法造模周期長,模型小鼠骨髓抑制較輕,與臨床慢性AA接近。
免疫介導;混合方法;化學方法;再生障礙性貧血
再生障礙性貧血(AA)患者多為青壯年,急性病例預后極差,僅慢性輕型病例有望獲得緩解或治愈。近年來人們?yōu)榱颂接慉A的發(fā)病機制及篩選有效的治療藥物,做了很多的研究和探討,而研究的深入有賴于良好的AA動物模型的建立。為此,筆者曾經在研究AA的藥物治療中,曾先后三次建立AA小鼠模型,本文擬探討一種方法簡便、成功率高、維持時間較長,與人類病理改變相似的AA小鼠模型的建立方法。
1.1.1 實驗動物 近交系 Balb/c小鼠45只,全雌,體重(18±2)g,DBA/2小鼠2只,全雌,體重(18±2)g,作為細胞供者。兩者均由上海市西普爾-必凱實驗動物有限公司提供,合格證號SCXK(滬)2008-0016。
1.1.2 胸腺淋巴結細胞懸液制備 將兩只DBA/2小鼠斷頸處死,95%酒精浸泡消毒5 min后,無菌取出胸腺及頸、腋下、腹股溝等處的淋巴結,加磷酸鹽(PBS)緩沖液,除去表面血污及黏附的結締組織。再次清洗后,用手術刀、剪刀反復剪切組織,研磨直到成糊狀,再經尼龍濾血網過濾,使之成為單細胞懸液。計數后配成1×106/ml濃度備用。
1.1.3 AA模型建立 取正常BALB/C小鼠45只,隨機取其中5只作為正常對照組,其余40只參照姚軍等〔1〕方法:將Balb/c小鼠40只經6.0 Gy60Coγ射線亞致死量全身3 min照射后,4 h內由尾靜脈輸入DBA/2小鼠的胸腺、淋巴結混合細胞懸液0.2 ml,輸注細胞數為1×106/0.2 m l/只。
1.2.1 實驗動物 ICR小鼠20只,全雄,體重(18±2)g,購于上海斯萊克實驗動物有限公司,合格證號:SCXK(滬)2007-0005。
1.2.2 實驗試劑 氯霉素(cH)陜西省西安婦幼制藥廠生產,批號:990617;環(huán)磷酰胺(CY)上海華聯(lián)制藥廠有限公司生產,批號:990406。
1.2.3 AA模型建立 20只小鼠一次全身3.0 Gy60Coγ射線照射(劑量率1.353 1 Gy/min,距離170 cm,照射時間2 min 13 s)。照射后第4、5、6天時腹腔注射環(huán)磷酰胺50.0 mg/kg及氯霉素62.5 mg/kg。
1.3.1 實驗動物 ICR小鼠50只,全雄,體重(18±2)g,由上海斯萊克實驗動物有限公司,合格證號:SCXK(滬)2007-0005。
1.3.2 AA模型建立 50只小鼠分為對照組10只:玉米油,2 ml/kg。背部皮下注射,3次/w(周一,周三,周五),總共注射35 d。腹腔注射同體積生理鹽水,1次/d,共7次。造模組40只:苯 +玉米油(1∶1配制),2 ml/kg(1 ml苯 +1 ml玉米油),背部皮下注射,3次/w(周一,周三,周五),總共注射15次。同時腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液50 mg/kg(產品批號:11061421,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)。1次/d,共7次。造模持續(xù)35 d。
2.1 方法一造模結果 給藥4 d后,造模組小鼠逐漸出現精神萎糜、大汗、皮毛稀疏、枯槁、體重明顯下降,在造模后的15 d內除1只小鼠外全部死亡。這與文獻報道的相吻合〔1〕。
2.2 方法二造模結果 造模結束后2 d,處死小鼠后,取小鼠股骨的長骨干及干骺端,甲醛溶液浸泡固定后,脫鈣,切片,然后HE染色后觀察骨髓切片病理,低倍鏡觀察組織結構:骨髓造血組織增生活躍,干骺端造血組織約占60%,骨干處增生度約為90%,可見三系各階段造血細胞,分布未見明顯異常。
2.3 方法三造模結果 造模結束后2 d,取小鼠眶靜脈血,用全自動血細胞分析儀計數做血常規(guī)計數,了解各組小鼠血常規(guī)變化。模型小鼠外周血及骨髓液流式細胞儀檢測結果,較正常組有明顯變化,顯示造模成功,且模型維持時間長。
AA小鼠的造模方法有很多種,包括物理,化學,免疫介導及混合方法等,各種方法各有其特點。物理方法多以γ射線、x射線等以致死量或亞致死量照射;化學方法中常用的藥物有白消安(馬利蘭)、環(huán)磷酰胺、氯霉素、苯劑等。Muir等〔2〕發(fā)現單純采用放射線造模各系細胞下降較為明顯,維持周期較長,但其射線還會損傷全身各器官,毒副作用大,照射劑量亦不容易掌握。陳俊等〔3〕研究發(fā)現,單純照射后第5天骨髓干細胞數處于極低水平,但第9天起造血干細胞開始明顯增加。似乎結論有相互矛盾之處?;瘜W藥物中,有研究發(fā)現利用白消安制造的AA動物模型,易使骨髓出現永久性損傷,而不符合造模的要求;張擎等〔4〕以環(huán)磷酰胺大劑量沖擊建立免疫紊亂動物模型,實驗動物雖有外周血常規(guī)一過性減低,但停藥后迅速回升;Lezama〔5〕單純用苯(加玉米油)誘發(fā)的小鼠再障模型,方法簡單,維持時間長,但誘導時間長達45 d。目前應用較多的模型是免疫介導的模型,即將DBA/2小鼠的胸腺淋巴結細胞(供體)輸注給受亞致死量照射的Balb/c小鼠(受體)體內,建立免疫介導AA模型。但免疫介導模型的建立實驗操作復雜,要求條件高,往往需要專業(yè)人員進行,且動物模型死亡快,有報道造模后第14天除1例外全部死亡〔1〕。
筆者先后三次造模,采用的分別是免疫介導、混合方法及化學方法,均根據相關文獻報道,由相關專業(yè)技術人員嚴格操作完成。第一次免疫介導法造模,因模型小鼠死亡快,不能滿足實驗藥物療效觀察的要求;第二次混合方法造模,骨髓活檢提示造模失敗,考慮與小鼠射線照射的劑量沒有很好把控有關;第三次化學方法造模,外周血中白細胞、紅細胞下降明顯,血小板無明顯改變,免疫T細胞及亞群中CD4+、CD4+/CD8+及CTLA-4+/CD28+的變化有統(tǒng)計學差異,其他雖有改變但無統(tǒng)計學差異,其中CD8+T細胞數、CD28+等指標的變化與文獻報道不符。
姚軍等〔1〕認為照射和淋巴細胞的輸入是造模兩個必需的條件,且要求兩者達一定劑量,任何單獨一個都不能引起造血衰竭。通過照射不僅降低了造血干細胞的數量,引起骨髓儲備力下降,而且削弱了宿主的免疫功能,使得輸入的淋巴細胞得以生存下來,通過某些途徑對宿主造血系統(tǒng)產生抑制。Chiu等〔6〕研究提示再障的發(fā)生是在骨髓造血干細胞數量減少到一定閾值的前提下繼發(fā)于輸入免疫活性細胞所致的免疫反應。陳俊等〔3〕實驗研究提示AA小鼠中存在抑制正常造血細胞的細胞,推測它們可能屬于T細胞,它們究竟是來源于供者小鼠的細胞,還是來源于受體小鼠本身細胞仍不清楚。而單純用苯、氯霉素、環(huán)磷酰胺等化學藥物造模的方法,操作簡便,易于控制。環(huán)磷酰胺是一種免疫抑制劑,苯對骨髓的毒性不在于苯本身而在于苯的有毒代謝產物--氫醌、苯醌等。氫醌通過抑制核因子-κB的活化而使造血前體細胞對細胞因子誘導的凋亡敏感性增高,從而產生造血抑制〔7〕。苯醌可以通過與DNA共價結合形成DNA加合物,增加了DNA的不穩(wěn)定性,導致DNA損傷〔8〕。氯霉素有學者〔9,10〕認為在遺傳敏感的個體中,能直接損傷細胞DNA,造成骨髓造血干細胞和微環(huán)境的缺陷,從而導致骨髓造血衰竭。
筆者認為,AA分為急性、慢性AA,預后有明顯差異,故在發(fā)病機制上兩者有所不同。免疫介導和混合方法形成的AA模型,造模速度快,外周血象及骨髓組織中造血細胞減少明顯,肝、脾的損傷、組織壞死明顯,與臨床上急性AA比較接近;而單純化學藥物聯(lián)合造模,造模周期較長,骨髓抑制情況較輕,肝、脾的變化以體積和重量的減少為主,組織壞死不明顯〔4〕,造模小鼠存活時間長,且模型維持時間長,與慢性AA情況比較符合,能滿足實驗藥效的觀察要求。所以,AA小鼠模型的建立方法,可以根據實驗目的的不同,加以選擇。
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江蘇省中醫(yī)藥科技項目立項計劃(LB09060)
邢海燕(1971-),女,碩士,副主任醫(yī)師,主要從事中西醫(yī)結合治療腫瘤、血液病研究。
〔2012-04-17收稿 2012-09-10修回〕
(編輯 曹夢園)