鐘藝華 李光勤 唐顯軍 (重慶市腫瘤研究所普內(nèi)科，重慶 400030)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷后的再生問題仍然是神經(jīng)康復中所面臨的難題。雖然在CNS損傷后，多重附加因素針對再生的阻礙作用和環(huán)境對于固有再生能力的對抗作用，導致軸突再生困難，但目前研究已肯定腦具有一定可塑性。臨床研究發(fā)現(xiàn)電刺激對CNS損傷具有良好的促修復效果，為損傷后的軸突再生提供了新的治療途徑。本文將重點討論CNS損傷后電刺激在促進軸突再生過程中所起的作用。

1 CNS損傷后軸突再生能力下降的原因

主要有兩個方面:首先，在CNS損傷初期，由于中樞灰質(zhì)的水腫和出血，以及供應相應區(qū)域的動脈血管痙攣，引起局部嚴重的缺血，導致在最初損傷的基礎(chǔ)上由于各種炎癥介質(zhì)的釋放造成二次損傷。這種損傷的發(fā)生是由于破壞了神經(jīng)細胞內(nèi)外的離子穩(wěn)態(tài)(包括細胞內(nèi)Ga2+和細胞外K+的平衡)，這種離子平衡的破壞與缺血、炎癥、出血引起的生物化學反應是一致的，能誘導軸突頂梢的枯死和回縮，導致神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)完整性的破壞和嚴重的功能缺失，使得其本身缺乏再生能力〔1〕。

其次，CNS損傷后生存微環(huán)境的破壞，包括神經(jīng)細胞釋放的神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTF)〔如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)及神經(jīng)營養(yǎng)因子(NT)-3等〕生成不足，以及各種內(nèi)在的神經(jīng)生長抑制因子〔如髓磷脂蛋白(NogoA)及少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG)等〕的產(chǎn)生，阻礙少突膠質(zhì)細胞的分化和髓鞘形成，影響神經(jīng)元的存活，導致軸突再生受到抑制。

2 電刺激促進CNS損傷后軸突再生的依據(jù)

電刺激作為一種治療手段已被廣泛應用于CNS損傷和疾病的功能恢復中。自20世紀80年代，5-溴脫氧尿核苷(BrdU)標記被廣泛應用于CNS神經(jīng)干細胞研究中，人們發(fā)現(xiàn)在損傷或病理狀態(tài)下，腦內(nèi)的主要存在于側(cè)腦室下區(qū)和海馬齒狀回顆粒下層的內(nèi)源性神經(jīng)干細胞(eNSC)能迅速地增殖和分化，具有替代損傷細胞的潛在能力，起到自發(fā)性修復的作用。另外，與腦內(nèi)干細胞不同，無論是在正常還是損傷的脊髓中，神經(jīng)干細胞只能分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞，而不能生成神經(jīng)元。一系列研究證實:很多因素可以影響脊髓內(nèi)神經(jīng)干細胞的生成，其中脊髓本身的電活動性具有很重要的作用。Li等〔2〕在正?；驌p傷的實驗動物中，將功能性電刺激(FES)植入大腦皮質(zhì)或周圍神經(jīng)干進行電刺激，發(fā)現(xiàn)可以增加脊髓內(nèi)eNSC的分化與增生，使脫髓鞘的軸突再髓鞘化，促進損傷的軸突再生，從而提高神經(jīng)組織的修復能力，證實了成熟的CNS損傷后仍具有有限的再生能力。因為再生依賴于切斷端軸突頂端的延伸能力，這種可再生長的軸突頂端被稱為生長錐，具有感知環(huán)境及引導軸突生長方向的能力。成功的軸突再生首先需要損傷軸突的神經(jīng)元必須是存活的，其次損傷的軸突必須能發(fā)芽并朝著目標區(qū)域生長，最后為了引導軸質(zhì)的流動，軸突在目標區(qū)域內(nèi)必須形成有功能的突觸聯(lián)系〔1〕。目前，誘導軸突生長已成為可能，這包括通過促進功能營養(yǎng)因子的釋放和中和生長抑制因子的生成來操縱CNS再生的固有過程。較多研究〔3〕已經(jīng)提示:在損傷的軸突周圍，應用外源性的弱電場可能是由于對生長的軸突提供了親神經(jīng)的引導，所以能加速軸突再生。

3 電刺激促進軸突再生的細胞機制

神經(jīng)細胞(包括神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞)能對電刺激作出直接反應。通過對損傷軸突的電刺激發(fā)現(xiàn)電活動在星形膠質(zhì)細胞的代謝調(diào)節(jié)中扮演著重要角色，該細胞能產(chǎn)生包括NTF在內(nèi)的各種化學因子，以促進軸突再生，髓鞘及突觸形成。例如:視神經(jīng)Mueller膠質(zhì)細胞，是一種特殊類型的視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細胞，對電刺激的反應是通過上調(diào)NTF(如BDNF和IGF-1)進行表達的;而抗BDNF的選擇性功能抑制性抗體能阻斷由電刺激增強的軸突外生，說明電刺激可能通過NTF加速軸突外生。此外，實驗證明視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)-上丘核的電活動對于穩(wěn)定突觸和允許RGCs有效競爭來源于目標的生存信號是十分重要的;同時，神經(jīng)元本身也能通過電活動增加NTF的產(chǎn)生，除了能增加包括BDNF和TrKB在下運動神經(jīng)元的表達外，也可以提高神經(jīng)元對這些營養(yǎng)因子的固有的敏感性。RGCs自身僅能很少對BDNF和其他肽類營養(yǎng)因子產(chǎn)生反應，而用電刺激卻能很大程度的提高其對營養(yǎng)因子的反應性。相似的效應在海馬神經(jīng)元中也被發(fā)現(xiàn)，因為電刺激能引起TrKB在海馬神經(jīng)元中表達的增加;反過來，BDNF能提高海馬神經(jīng)元對電刺激的反應，支持在電刺激和營養(yǎng)因子之間存在協(xié)同的雙向的交互作用。當軸索斷裂后，神經(jīng)元能通過上調(diào)再生相關(guān)基因增加胞體的反應，轉(zhuǎn)錄上調(diào)生長相關(guān)的蛋白(如 GAP-43，CAP-23和SCG10等)，這些蛋白在生長錐中作用于第二信使系統(tǒng)，通過影響細胞骨架結(jié)構(gòu)的變化，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而促進軸突生長和調(diào)控新的突觸連接〔4〕。對于細胞骨架結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)是通過上調(diào)細胞骨架蛋白(包括Tα-1-微管蛋白和肌動蛋白)來滿足生長錐發(fā)展的需要，從而促進軸突再生〔5，6〕。

4 電刺激促進軸突再生的分子機制

在電刺激促進神經(jīng)元存活和軸突再生的效應中，許多分子信號途徑參與調(diào)節(jié)〔7〕。

(1)P13/AKT在電活動依賴的神經(jīng)保護和再生中，這種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶途徑通過激活許多縮氨酸營養(yǎng)因子調(diào)節(jié)其效應〔8〕。在體外，IGF-1能通過經(jīng)由AKT激活的環(huán)磷酸腺苷反應元件蛋白(CREB)提高PC12神經(jīng)元細胞系的存活，從而導致抗凋亡基因bcl-2的啟動子的活動增加〔9〕。在鼠的視神經(jīng)橫斷后電刺激角膜的模型中，IGF-1也能通過激活AKT信號調(diào)節(jié)電活動誘導的RGCs的神經(jīng)保護和再生作用〔10〕。

(2)MEK/ERK在神經(jīng)元中，活化的有絲分裂原蛋白激酶(MAPK)或MEK/ERK通路在去極化后能被激活。在海馬神經(jīng)元中，膜電位局部閾下值的改變也能激活MAPK信號通路〔11〕。在體外，MEK/ERK通路參與了RGCs對于NTF的生存應答，而抑制這條通路能阻斷由電活動和BDNF引起的軸突存活和生長的效應。應用包括ERK激活在內(nèi)的機制，去極化也能促進顆粒狀小腦神經(jīng)元的存活〔8〕。并且，MAPK/ERK通路通過調(diào)節(jié)CREB的磷酸化作用有助于活動依賴性基因的表達〔12〕。

(3)鈣/鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶(CaMKs)在通過增加細胞內(nèi)Ca2+來調(diào)節(jié)信號通路激活的過程中起著十分重要的作用。CaMKsⅡ?qū)τ诓煌l率和持續(xù)時間的Ca2+振幅有不同的反應，能將局部增加的Ca2+轉(zhuǎn)化為基因表達〔13〕，這可能是通過NFκB的激活和從胞質(zhì)到胞核的運輸起作用〔14〕;在樹突中也能通過誘導沒有新基因表達的要素約束蛋白(CPEB)來調(diào)節(jié)局部的蛋白合成，這種機制在突觸可塑性和長期存活中起著作用〔15〕。另外，CaMKsⅣ在調(diào)整一些轉(zhuǎn)錄因子和通過活動依賴基因的表達調(diào)節(jié)神經(jīng)元的可塑性方面都是必要的。并且，CaMKsⅡ為了整合突觸后效應而特別集中在突觸，說明CaMKs總是處于理想的位置對特別水平的電活動作出反應。

(4)NFκB通過調(diào)節(jié)活性依賴性神經(jīng)營養(yǎng)因子(ADNF)和活性依賴性神經(jīng)保護因子(ADNP)的效應而參與到活動依賴性的神經(jīng)保護中。這些多肽類首先作為血管活性腸肽(VIP)神經(jīng)保護效應的介質(zhì)而被發(fā)現(xiàn);并在脊髓培養(yǎng)中，通過對電活動的反應和調(diào)節(jié)其神經(jīng)保護效應而被分泌。這些來源于ADNF(ADNF-9)和ADNP的多肽類在缺乏生長因子介質(zhì)的RGCs人工培養(yǎng)中，能顯著地增加軸突的存活和生長〔16〕。最近，ADNP被證明對于體內(nèi)的RGCs而言，在視網(wǎng)膜局部缺血和視神經(jīng)粉碎的動物模型中起到了重要的保護和再生作用〔17〕。

(5)cAMP在RGCs中，通過提高cAMP能模仿由于去極化引起的NTF對軸突存活或生長的增強效應，而阻斷cAMP的提高或抑制下游的蛋白激酶A(PKA)能廢除這種電活動效應。因此，cAMP對于電活動誘導的RGCs的軸突存活和生長而言將是一種重要的介質(zhì)。cAMP能補充細胞表面的NTF受體，并在長時間內(nèi)增加受體的基因表達;也能激活鳥嘌呤核苷酸交換因子，具有促進神經(jīng)元的增殖，分化和軸突生長的作用;在去極化的細胞中能激活鈣依賴的Ga2+釋放，并提高突觸神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而加強電活動;還能激活磷酯酶C和D，及其后的PKC，導致在背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元中活動的敏化作用;并且，在RGCs中也能調(diào)節(jié)N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)受體的反應。這樣，有許多通路通過cAMP調(diào)節(jié)電刺激與神經(jīng)元存活和軸突生長之間的關(guān)系。在運動神經(jīng)元中，假定存在基礎(chǔ)水平的cAMP，注射rolipram(神經(jīng)磷酸二酯酶Ⅳ的特殊抑制劑)將通過增加運動神經(jīng)元的數(shù)量加速軸突外生，這種效應與電刺激相似〔18〕。毛喉素能通過刺激腺苷環(huán)化酶增加內(nèi)源性cAMP。聯(lián)丁?；鵦AMP(dbcAMP)，一種可溶性cAMP類似物，能通過增加運動神經(jīng)元的數(shù)量擴大神經(jīng)突及其長度〔19〕。SQ22356，一種強效的可溶性腺苷環(huán)化酶抑制劑，能降低內(nèi)源性cAMP，在神經(jīng)元中引起劑量依賴性衰減而擴大神經(jīng)突及其長度。研究人員通過實驗發(fā)現(xiàn)在人工培養(yǎng)的運動神經(jīng)元中，毛喉素和dbcAMP是通過使PKA RIIB亞組磷酸化來相應地增加神經(jīng)元的神經(jīng)突數(shù)量及其長度的，而由cAMP升高引起的PKA磷酸化作用和增加神經(jīng)突長度的效應能通過cAMP/PKA抑制劑-H89減弱，從而說明cAMP對電刺激的反應是通過PKA加速軸突外生而起作用。然而，不像DRG感覺神經(jīng)元的cAMP在試管內(nèi)激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)下游的PKA，作為對毛喉素和dbcAMP的反應，提高運動神經(jīng)元的cAMP并沒有在基礎(chǔ)水平上使ERK2磷酸化，或是增加pERK/總ERK的比例;即使通過SQ22356和H89減少cAMP，也并不能改變ERK2的磷酸化作用，這與在運動神經(jīng)元中基礎(chǔ)水平的ERK2不依賴cAMP激活相一致。因此，在cAMP促進運動軸突生長的效應中，ERK活化作用并不是必要的。綜上所述，電刺激能提高cAMP，經(jīng)PKA上調(diào)BDNF和TrKB，并依次上調(diào)再生相關(guān)基因進而促進軸突外生。然而，不像感覺神經(jīng)元，cAMP在運動神經(jīng)元中影響神經(jīng)突外生并沒有通過ERK通路的調(diào)節(jié)〔18〕。

5 電刺激模式的選擇與軸突再生的關(guān)系

通過電刺激誘導基因表達的差異依賴于其特定模式的應用，包括刺激頻率、持續(xù)時間和波形的參數(shù)調(diào)節(jié)。在色素性視網(wǎng)膜炎(RP)病人中，兩相的脈沖相對于單相的刺激能更好地持續(xù)地誘導光幻視;間歇性的脈沖較連續(xù)性的具有更強的神經(jīng)保護作用。例如:電刺激模式能決定視網(wǎng)膜Mueller細胞中IGF-1的上調(diào);K+去極化依賴于L-型Ca2+通道和MAPK信號通路;復制的電刺激依賴于N-型Ca2+通道和PKA，PKC信號通路;用4 Hz的電刺激小腦中的并行纖維能引起長期增益效應(LTP)，這種作用是通過突觸前的cAMP機制調(diào)節(jié);而用1 Hz的電刺激相同的纖維能引起突觸后的LTP，但所需要的是NO而不是cAMP〔20〕;電刺激脊髓灰質(zhì)后角神經(jīng)元的傳入纖維C能導致頻率依賴的ERK的磷酸化作用，更高頻率(10 Hz)的電刺激通過NMDA能誘導更多的pERK通道信號;反之，更低頻率誘導更少的信號，說明刺激頻率在激活的分子途徑中是十分關(guān)鍵的。在CaMKsⅡ途徑中，Ca2+的短暫增加較持續(xù)提高能產(chǎn)生更強的目標活化作用，證明Ca2+的簡諧運動在軸突的誘導生長中扮演著重要的角色;而且，生長錐能對Ca2+瞬態(tài)的特別頻率作出反應，包括在中頻(1 Hz附近)時軸突生長和在更低或更高的頻率時生長錐停止生長或回縮。此外，對于每種神經(jīng)元類型決定最佳的刺激參數(shù)也是必需的。比如在視網(wǎng)膜對外源性電刺激的反應中，對于特定的脈沖持續(xù)時間，不同的細胞層具有傾向性的反應;而且，隨著脈沖持續(xù)時間的增加，刺激的閾值在下降。但對于RGCs和其他神經(jīng)元的神經(jīng)保護和再生的最佳刺激參數(shù)還沒有最終決定。

6 總結(jié)和展望

綜上所述，電刺激促進CNS損傷后的軸突再生的作用機制主要表現(xiàn)在以下兩個方面:①可引起局部NTF的釋放，產(chǎn)生保護中樞神經(jīng)細胞的效應。②產(chǎn)生上行傳導的神經(jīng)信號，使中樞胞體產(chǎn)生動作電位，在軸突再生，少突膠質(zhì)細胞分化和髓鞘形成，神經(jīng)元存活等方面發(fā)揮促進作用。目前FES在臨床上取得良好的治療效果，但由于需要外科手術(shù)植入，操作復雜，存在一定的風險性和治療費用高等缺點，所以很多專家希望能利用電針針刺治療克服FES的不足。電針針刺治療作為電刺激的另一種治療方式，將為CNS損傷后促進軸突再生提供新的研究思路和手段〔2〕。

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