李春女， 李 淞， 李秀杰， 張淑琴， 梁建民

致癲過程包括分子、細胞和神經(jīng)元網(wǎng)絡的級聯(lián)變化［1］:神經(jīng)元網(wǎng)絡早期急性損害在最初數(shù)分鐘至數(shù)天出現(xiàn)，包括神經(jīng)細胞膜除極引起的離子通道動力學快速變化、功能蛋白的翻譯后修飾和即早基因(immediate early gene，IEGs)活化;在數(shù)小時至數(shù)周出現(xiàn)的亞急性反應包括轉錄事件、神經(jīng)元死亡和炎癥級聯(lián)反應;在數(shù)周至數(shù)月出現(xiàn)的慢性反應主要包括解剖學改變:如神經(jīng)發(fā)生、苔蘚纖維發(fā)芽、神經(jīng)網(wǎng)絡重建和膠質增生。IEGs編碼蛋白作為神經(jīng)細胞表面受體、胞質第二信使系統(tǒng)和核內(nèi)特異靶基因間胞內(nèi)信號轉導的第三信使，可作為轉錄因子上調(diào)或下調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)效應基因表達。因此，IEGs被喻為神經(jīng)元短期興奮性轉變?yōu)殚L期癲癇表型的分子開關［2］，此外，IEGs也是癲癇后神經(jīng)元凋亡的重要調(diào)控因子之一［3］。zif268(也稱為 Egr-1、NGFI-A 或Krox 24)由Milbrandt于1987年首先克隆發(fā)現(xiàn)的一種IEGs［4］。zif268與長期記憶、空間記憶能力的鞏固密切相關［5］，可能是調(diào)節(jié)記憶相關蛋白合成的關鍵因子，也可能參與癲癇病理過程［6，7］。我們過去發(fā)現(xiàn)顳葉癲癇大鼠存在空間記憶損害［8］，本研究探討海馬zif268時空表達與顳葉癲癇腦損傷的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 健康雄性Wistar大鼠83只，體重約250g，月齡約2.5月，購于本校實驗動物部。試劑:KA和DEPC(美國Sigma公司)、多聚甲醛(北京化學試劑公司)、zif268mRNA原位雜交試劑盒和Zif268免疫組織化學試劑盒(美國 Santa cruz公司)。儀器:立體定位儀(美國)、HPIAS-1000高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)(日本)。

1.2 動物分組 Wistar大鼠83只，麻醉死亡2只，點燃后抽搐死亡3只，最終參與實驗78只，包括正常組6只，Sham組和TLE組各36只。后兩組按點燃或假手術后 6h、24h、72h、7d、14d、21d 時間點分為6小組，每小組6只。

1.3 顳葉癲癇模型建立 按以往方法［8］，在立體定位儀下，采用KA杏仁核微量注射方法建立大鼠顳葉癲癇點燃模型。按Racine分級標準將大鼠癲癇發(fā)作分為0～Ⅴ級［9］，大鼠出現(xiàn)Ⅳ級或以上發(fā)作者為點燃成功。假手術組杏仁核注射與KA等體積的PBS緩沖液。

1.4 石蠟切片標本制備 分別于點燃或假手術后6h、24h、72h 和 7d、14d、21d 再次麻醉大鼠，經(jīng)4%多聚甲醛液心臟灌注固定后取腦，以視交叉后4mm和8mm處行冠狀切片，片厚4mm，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，切成5μm厚連續(xù)冠狀切片。

1.5 原位雜交檢測 原位雜交過程按zif268mRNA原位雜交試劑盒說明書操作:主要步驟為切片脫蠟、二甲苯和梯度乙醇處理后用0.01%曲拉通X-100溶液浸泡，用3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，復合消化液暴露mRNA片段，預雜交，雜交，切片，IgG封閉和阻斷，滴加生物素化抗地高辛抗體;滴加高敏TSP(ZYMED)SABC過氧化物酶復合物，DAB劑顯色，蘇木素復染，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后光鏡觀察，陽性表達細胞被染成棕黃色。

1.6 免疫組織化學檢測 Zif268蛋白表達采用免疫組織化學ABC法，用生物素標記的第二抗體與鏈霉親和素蛋白連接的過氧化酶及基質混合液的反應來測定細胞中的抗原，按試劑盒說明進行:包括切片脫蠟、二甲苯和梯度乙醇處理后用0.01%曲拉通X-100溶液浸泡，用3%H2O2處理，正常山羊血清封閉后，滴加特異性第一抗體，37℃濕盒孵育2h，內(nèi)源性生物素封閉和阻斷，滴加特異性生物素化第二抗體，37℃濕盒孵育50min，DAB顯色5min，蘇木素復染，封片，光鏡觀察。每次染色均以PBS代替第一抗體作為陰性對照。

1.7 圖像分析和統(tǒng)計學處理 在200倍放大顯微鏡下，zif268mRNA表達主要在神經(jīng)元胞質出現(xiàn)棕褐色顆粒物質，Zif268蛋白表達主要在神經(jīng)元胞核顯棕色。在每只大鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)隨機各選擇5個不重疊視野，雙盲法統(tǒng)計zif268mRNA或Zif268蛋白表達陽性細胞數(shù)的均值分別記為每只大鼠海馬相應區(qū)域zif268mRNA或Zif268蛋白的表達量，結果以均數(shù)±標準差(χ±s)表示，記錄后繪制統(tǒng)計圖。應用SPSS 13.0軟件單因素方差分析和Logistic回歸分析進行數(shù)據(jù)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 行為學觀察 KA注射后平均50min左右大鼠出現(xiàn)癲癇發(fā)作，最初表現(xiàn)為凝視、顫動、點頭等部分性發(fā)作動作，隨后出現(xiàn)Racine IV級或以上發(fā)作，以前肢痙攣旋轉、站立傾倒和四肢抽搐等為主，部分出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)。假手術組未見癲癇發(fā)作。

2.2 點燃成功率 參與點燃大鼠共41只，麻醉死亡2只，抽搐出現(xiàn)呼吸抑制死亡3只，點燃成功率為87.8%。假手術組36只無死亡者。

2.3 海馬各區(qū)或各時間點zif268mRNA表達

正常組和Sham組海馬各區(qū)總體陽性細胞表達率(positive cell count，PCC)無差異(P ＞0.05)，組內(nèi)比較均為 DG表達高于 CA1和 CA3區(qū)(P＜0.05)。TLE組海馬各區(qū)均高于Sham組(P＜0.05)，與正常組和Sham組不同，組內(nèi)不同區(qū)域表達無差異(P＞0.05);TLE組在點燃后24h海馬zif268mRNA出現(xiàn)表達高峰，7d最低，在14d和21d有所回升;點燃后6h、24h、14d、和 21d 高于 Sham 組(P ＜ 0.05);在21d海馬各區(qū)zif268mRNA表達均高于Sham組(P＜0.05)。Logistic回歸分析顯示海馬 zif268mRNA陽性細胞表達率與顳葉癲癇呈正相關(β=0.286，P＜0.001)。

2.4 海馬各區(qū)或各時間點Zif268蛋白表達正常組和Sham組海馬各區(qū)總體陽性細胞表達率無差異(P＞0.05)，組內(nèi)比較均以 DG表達高于CA1和CA3區(qū)(P＜0.05)，與 zif268mRNA表達一致。TLE組與zif268mRNA表達不一致，組內(nèi)比較，DG表達高于CA1區(qū)(P＜0.05)，與CA3區(qū)無差異(P＞0.05)，組間比較，DG表達低于 Sham組(P＜0.05);TLE組在點燃后6h海馬Zif268蛋白表達出現(xiàn)高峰，隨后降低，在14d升高，在21d再次降低;在點燃后24h和7d低于Sham組(P＜0.05)，在14d高于Sham組(P＜0.05);在21d海馬CA1和CA3區(qū)均高于Sham組(P＜0.05)，DG表達與與zif268mRNA表達不一致，低于Sham組(P＜0.05)。Logistic回歸分析顯示海馬Zif268蛋白陽性細胞表達率與顳葉癲癇呈負相關(β =-0.153，P ＜0.001)。

3 討論

與癲癇相關的神經(jīng)細胞基因表達變化分為早期反應和后期反應，早期反應基因為即早基因(IEGs)，通常編碼轉錄因子作為第三信使調(diào)節(jié)后期反應基因的表達，引起長期慢性表型改變，最終可能導致癲癇的產(chǎn)生和反復發(fā)作。研究表明，幾乎所有驚厥活動均可引起邊緣系統(tǒng)神經(jīng)元IEGs動態(tài)表達變化，也包括非邊緣系統(tǒng)，如皮層、紋狀體和丘腦［1］，此外，許多IEGs參與調(diào)節(jié)癲癇后海馬神經(jīng)細胞的損傷與抗損傷過程［3］?？梢姡琁EGs活化是致癲過程的重要環(huán)節(jié)之一［2］。

zif268是一種活性誘導依賴性表達的IEGs，是Egr家族成員，編碼82kDa或88kDa的Zif268蛋白，胞漿中的Zif268可被激活為轉錄因子ZIF268而移至胞核，ZIF268具有3個連續(xù)的鋅指結構，與調(diào)節(jié)序列 GCGC-TGGGCG結合，調(diào)控效應基因的轉錄［4］。目前認為突觸長時程增強效應(long term potentiation，LTP)構成了學習記憶的生理基礎，Zif268蛋白是LTP維持階段的必須成分，Zif268缺陷則引起晚相LTP消失，24h后記憶喪失［10］。Zif268失活小鼠會出現(xiàn)記憶缺失［11］。最近的研究表明，Zif268是背側海馬記憶重現(xiàn)的再鞏固過程的必需要素［12］。因此，Zif268可能是調(diào)控記憶相關蛋白表達的關鍵轉錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，Zif268不僅調(diào)節(jié)記憶功能，也參與癲癇后神經(jīng)元的病理損傷過程。戊四唑致癇大鼠海馬zif268mRNA表達增高［6］;電壓依賴型T型Ca(V)3.2通道與失神癲癇關系密切，Zif268可直接作用于Ca(V)3.2通道基因啟動子區(qū)，促進其轉錄［13］;Liang等在運動皮層注射破傷風毒素誘導的大鼠慢性局灶型癲癇，發(fā)現(xiàn)Zif268表達在注射點增高，在注射點周圍降低，推測Zif268可能對產(chǎn)生和維持局灶型癲癇起重要作用［7］。由于顳葉難治性癲癇Zif268相關報道極少，本研究采用KA杏仁核點燃成功建立了經(jīng)典的顳葉難治性癲癇大鼠模型［8］，并動態(tài)觀察了海馬 zif268mRNA及其蛋白的時空表達。

本研究表明，正常海馬各區(qū)zif268mRNA表達不完全一致，DG表達高于CA1和CA3區(qū)，Sham組與正常組海馬zif268mRNA區(qū)域分布無明顯差異，癲癇組海馬 CA1、CA3和DG區(qū)表達較Sham組增高。顳葉癲癇點燃后zif268mRNA表達的早期峰值、波動幅度和晚期表達均高于假手術組。Honkaniemi 等 報 道［14］，KA 點 燃 后 可 快 速 誘 導zif268mRNA在海馬、皮質、杏仁核表達增高，多數(shù)腦區(qū)24h開始逐漸降低至基礎水平，但在CA1、CA3仍保持相對高水平，與本研究結果不完全一致。本研究發(fā)現(xiàn)，顳葉癲癇點燃后遠期海馬Zif268蛋白在海馬DG存在區(qū)域性表達降低，提示顳葉癲癇點燃后遠期海馬DG可能存在Zif268蛋白翻譯效率降低或蛋白穩(wěn)定性降低等蛋白合成紊亂現(xiàn)象，可能與神經(jīng)元死亡有關［14］。形態(tài)學資料已經(jīng)證實癲癇存在苔蘚纖維(mossy fiber，MF)發(fā)芽，并與癲癇的形成及其可塑性的建立密切相關。多數(shù)學者認為，CA3區(qū)神經(jīng)元丟失導致DG顆粒細胞與自身胞體產(chǎn)生回返性突觸聯(lián)系是MF發(fā)芽的主要機制。在本研究中，癲癇組21d海馬DG區(qū)zif268mRNA與其蛋白表達偏離，提示DG區(qū)可能存在較為長期的蛋白合成紊亂、較為嚴重的神經(jīng)元損傷和較少的神經(jīng)元再生，神經(jīng)修復機制可能被過度激活，可能是海馬MF發(fā)芽的病理基礎或反映?；貧w分析提示顳葉癲癇與海馬zif268mRNA表達呈正相關，與Zif268蛋白表達呈負相關，提示海馬即早基因zif268及其蛋白的時空表達變化可能參與KA點燃顳葉癲癇病理過程。

總之，顳葉癲癇的發(fā)病機制可能是一系列生物學事件級聯(lián)結果，其中IEGs表達是其中的重要環(huán)節(jié)之一。我們過去研究發(fā)現(xiàn)，顳葉癲癇大鼠存在空間記憶能力損害［8］，推測海馬zif268及其蛋白時空表達改變可能是顳葉癲癇記憶損害的途徑之一，還有待進一步研究。

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