王小青，趙紅玲，高 楊，王良友，尹志峰

(河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000)

皮膚真皮中膠原蛋白減少被認(rèn)為是人體衰老形成皺紋的主要原因，因此，如果能夠促進(jìn)皮膚合成更多的膠原蛋白，那么將會(huì)有效逆轉(zhuǎn)衰老從而減少皺紋。小分子多肽類用于抗皺產(chǎn)品已經(jīng)有很多年[1-2]。每年都有大量多肽類抗皺的產(chǎn)品上市，從早期的乙?；鍎匐牡阶貦磅９央摹Ｗ貦磅Ｎ咫?3(Matrixyl)是棕櫚酰寡肽系列抗皺多肽小分子的一種。

Matrixyl中的活性小分子是“微膠原蛋白”，該小分子多肽通過(guò)含有Matrixyl的乳膏深入皮膚，到達(dá)成纖維細(xì)胞。在成纖維細(xì)胞合成皮膚連接組織的小分子，如膠原蛋白和蔗糖糖胺，這些合成的分子參與構(gòu)成皮膚基質(zhì)[3]。

本研究采用Fmoc固相多肽合成法，用逐步縮合的策略合成了由5個(gè)氨基酸以及一個(gè)棕櫚酸組成的棕櫚酰五肽-3，合成路線[3-4]。見(jiàn)附圖。

附圖 棕櫚酰五肽-3合成路線圖

1 儀器與材料

1.1 儀器 ALLtechPH426型反相高效液相色譜儀(UV檢測(cè)器，美國(guó)Alltech公司);Newstyle型反相高效半制備液相色譜儀(蘇州漢邦科技有限公司);Agilent1200系列高效液相-ESI質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司);Heal Force系列純水機(jī)(香港力康公司);CHRIST凍干機(jī)(北京博勵(lì)行儀器有限公司);高速大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);752型紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);AR224CN型分析天平(美國(guó)奧豪斯儀器上海有限公司)。

1.2 藥品與試劑 Wang-Resin(天津南開(kāi)合成科技有限公司，替代度為1.17mmol/g);3種Fmoc保護(hù)基的氨基酸(蘇州中科天馬肽工程中心有限公司)、棕櫚酸(國(guó)藥試劑有限公司);1-羥基苯并三氮唑(HOBt)(蘇州中科天馬肽工程中心有限公司)，N, N-二異丙基碳二亞胺(DIC);哌啶，三氟乙酸(TFA)，苯甲硫醚(國(guó)藥試劑有限公司)，苯甲醚，乙二硫醇(EDT)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，冰乙醚和二氯甲烷(DCM)，以上試劑均為分析純;乙腈(色譜純，天津科密歐試劑有限公司)，超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

2 檢測(cè)方法、制備、裂解與鑒定

2.1 替代度檢測(cè)方法 精密稱取干燥至恒重的AAWang Resin2份，各約8.0mg，分別置于2ml離心管中，加入20%哌啶DMF溶液(V:V)溶液1ml，室溫振蕩20min，脫去Fmoc保護(hù)基。取離心管上清液200μl置于10ml比色管中，DMF 10ml稀釋、搖勻，待測(cè)。將20%哌啶DMF溶液(V:V)200μl用10ml DMF稀釋、搖勻，作為空白對(duì)照。于波長(zhǎng)301nm處，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各溶液的吸收值(A)。按照公式 計(jì)算替代度，式中，A為測(cè)得的吸光度值;51為稀釋倍數(shù);Sub為每克樹(shù)脂中連接的氨基酸的毫摩爾數(shù);ε為Fmoc結(jié)構(gòu)在301nm處的特征吸收值，本實(shí)驗(yàn)室校正值6 L(mmol×cm)-1;m為稱取的樹(shù)脂質(zhì)量(單位為mg)。

2.2 茚檢方法 固相多肽合成中，主要是通過(guò)檢測(cè)樹(shù)脂上游離氨基來(lái)判斷連接效率，檢測(cè)方法稱為Kaiser方法，試劑包括:6%茚三酮的乙醇溶液、80%苯酚的乙醇溶液、2% 0.001M KCN的吡啶溶液，配制中的吡啶需要加茚三酮回流，重蒸后再使用。

取少量樹(shù)脂，加入A、B和C各2-3滴，100℃下加熱1-2min，如果溶液有藍(lán)色，樹(shù)脂出現(xiàn)藍(lán)色或紅褐色，表明還有游離氨基，否則說(shuō)明連接完全。

2.3 HPLC-MS 分析方法:色譜條件:色譜柱為Accurasil C18柱(4.6mm×250mm，5μm);流動(dòng)相為A:0.1%TFA/H2O，B:0.1% TFA/CH3CN，5%-95%B 梯度洗脫20min，流速為0.2ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm，樣品濃度1mg/ml，進(jìn)樣量10μl。質(zhì)譜條件:掃描范圍100-1200。

2.4 Fmoc-Ser(tBu)-Wang Resin的制備把1.71g Wang Resin投入到反應(yīng)柱中，DMF洗滌一次，抽干;用適量干燥二氯甲烷常溫溶漲，N2吹拂攪拌30min至樹(shù)脂充分溶脹，抽干液體;DMF洗滌一次，抽干;重蒸DMF洗滌一次，抽干。加入3.07g Fmoc-Gly-OH、1.30g HOBt、1.49ml DIC的DMF/DCM(1:1)溶液5ml。反應(yīng)5min后，加入0.10g DMAP，反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后，抽干反應(yīng)液，用DMF洗滌三次抽干，取出少許樹(shù)脂進(jìn)行替代度檢測(cè)。隨后加入200ml封閉試劑(AC2O/吡啶(7:6，V:V))，反應(yīng)8-16h，DMF洗滌2次;無(wú)水甲醇洗兩次(10min/次)，真空減壓干燥至恒重。測(cè)得Fmoc-Ser(tBu)-Wang Resin的替代度為0.71mmol/g。

2.5 Matrixyl-Wang Resin的 制 備 ① 在Fmoc-Ser(tBu)-Wang Resin反應(yīng)柱中，加入DCM溶漲20-30min，抽掉。加入DBLK溶液(哌啶/DMF(V/V)=1:4)脫保護(hù)2次(5+10min)，兩次脫保護(hù)之間需加入DMF洗滌1min，抽掉。兩次脫完保護(hù)抽掉后再用DMF，甲醇，DCM，DMF，各洗滌1次，用玻璃棒挑取少許樹(shù)脂，茚檢，顯深紫紅色，表明Fmoc已脫，待投料。②在脫保護(hù)的過(guò)程中，稱取2.93g Fmoc-Lys(Boc)-OH和0.81g HOBt置燒杯中，加入2ml精制DMF溶解，待完全溶解后，將燒杯放入冰浴中冷卻2min，然后再加入0.93ml DIC于溶液中活化8min，若出現(xiàn)白色絮狀泡沫表明活化已完全，用布氏漏斗將活化液中的白色固體小顆粒濾去，將得到的澄清濾液倒入反應(yīng)柱中，再加入DMF于反應(yīng)柱中，調(diào)節(jié)好N2，使樹(shù)脂被均勻吹起，套上干燥管，并要保持在反應(yīng)過(guò)程中無(wú)掛壁現(xiàn)象出現(xiàn)，若出現(xiàn)掛壁，用少許精制DMF將壁上的樹(shù)脂沖到反應(yīng)液中。室溫反應(yīng)2h，茚檢合格后可抽掉反應(yīng)液繼續(xù)連接下一個(gè)氨基酸。

2.6 Matrixyl-Wang Resin的裂解 將干燥至恒重的Matrixyl-Wang Resin0.10g置于玻璃燒瓶中，冰浴攪拌下加入TFA-苯甲硫醚-苯甲醚-EDT(體積比95:5:3:2)4ml，反應(yīng)30min，逐漸升至室溫，于室溫下反應(yīng)2h。過(guò)濾，用少許TFA洗滌樹(shù)脂，將濾液傾入40ml無(wú)水冰乙醚中，析出白色固體，4000rpm離心4min，棄去上清液，重復(fù)2次，真空干燥，得粗肽46.6mg。

2.7 Matrixyl粗肽的分析鑒定 粗品Matrixyl進(jìn)行RPHPLC分析，純化后Matrixyl的HPLC-ESI-MS分析可知其m/z 402.3{[M+H]2+}，Matrixyl的分子量為802.05，理論值與實(shí)際值相符。

3 討論

棕櫚酰五肽-3為短肽，為提高最終產(chǎn)量，應(yīng)盡可能提高替代度。本研究對(duì)反應(yīng)時(shí)間、縮合試劑以及氨基酸比例等多種因素進(jìn)行優(yōu)化，最終使替代度達(dá)到0.71mmol/g，相當(dāng)于替代86.6%。

本研究對(duì)棕櫚酰五肽-3 的裂解試劑進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)幾種裂解液配比進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TFA-苯甲硫醚-苯甲醚-EDT(體積比95:5:3:2)配比裂解后純度高，雜質(zhì)少，易于純化，使本次實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虻玫郊兌容^高的棕櫚酰五肽-3，為棕櫚酰五肽-3的固相合成研究提供一種可行的方法。

[1] 李校坤,姚成燦,黃亞?wèn)|,等.生物活性多肽護(hù)膚品的基礎(chǔ)及應(yīng)用[J].日用化學(xué)工業(yè),2002,32(5):41-44.

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