張 艷，王 福，喬志燕，梅立新，溫海玲，陳志宏△

(1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000;2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

2型糖尿病是一種遺傳和環(huán)境因素共同作用形成的多基因遺傳性復(fù)雜疾病，可直接引起肝臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷。肝臟是貯存糖原的重要器官，糖代謝過程中某些酶活性的變化將導(dǎo)致肝糖原的含量發(fā)生變化。多數(shù)動物實驗表明，高血糖動物模型肝臟糖原含量下降，經(jīng)典降糖西藥二甲雙胍可通過增加糖原合成等作用降低血糖[1];許多降血糖的中藥也可通過增加肝糖原含量發(fā)揮降血糖的作用[2]。蠶繭提取物—絲膠是一種由18種氨基酸組成的高分子水溶性蛋白，本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，絲膠能有效降低2型糖尿病大鼠的血糖，并對糖尿病血糖升高具有一定的預(yù)防作用[3]。本研究通過觀察絲膠對2型糖尿病大鼠肝糖原含量的影響，探討絲膠降血糖作用的機制及對肝糖原儲備的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，購于美國Sigma公司，臨時用pH4.4的枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液配成2%的溶液。絲膠為彩色蠶繭經(jīng)浸泡、水煎、過濾、濃縮而成。RM2125 RT切片機，德國Leica公司;BH-2型OLYMPUS顯微鏡及攝像裝置，日本Olympus公司。

1.2 實驗動物的分組與處理 清潔級雄性SD大鼠60只，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(合格證號:712024)，體重200-250g。將大鼠隨機分為5組:正常對照組、糖尿病模型組、絲膠治療組、陽性對照組、絲膠預(yù)防組，每組12只。模型組、絲膠治療組、陽性對照組大鼠均采用2% STZ(25mg/kg，3d)連續(xù)腹腔注射建立糖尿病動物模型，一周后以血糖≥16.7mmol/L作為成模標(biāo)準。待模型成功建立后，模型組大鼠不做任何處理;絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4g/kg/d)連續(xù)灌胃35d;陽性對照組大鼠給予二甲雙胍(55.33mg/kg/d)連續(xù)灌胃，時間同絲膠治療組。絲膠預(yù)防組大鼠于連續(xù)注射STZ(25mg/kg)前給予絲膠(2.4g/kg/d)灌胃35d。

1.3 檢測血糖 各組大鼠禁食12h以上，4%水合氯醛腹腔注射，成功麻醉后，經(jīng)內(nèi)眥于眶后靜脈叢采血，京立LD4-2A離心機3000r/min離心20min，收集血清，應(yīng)用日立公司全自動臨床生化分析儀采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖。

1.4 肝糖原含量的檢測及定量分析 大鼠取血后斷頭處死，取肝臟，置于Bouins液固定，常規(guī)石蠟包埋。Leica石蠟切片機連續(xù)切片，片厚5μm，行過碘酸雪夫染色(periodic acid-schiff stain，PAS)染色。切片脫蠟后，入95%乙醇60min，1%過碘酸氧化液40μl染色5-10min;蒸餾水洗后滴加Schiff試劑20μl，染色10-15min;棄掉玻片上多余的Schiff試劑后，滴加0.5%偏重亞硫酸鈉50μl，連續(xù)3次，每次間隔1-2min;流水沖洗后蘇木素復(fù)染細胞核，常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對照采用淀粉酶消化處理組織切片;以胞漿出現(xiàn)紫紅色顆粒為陽性結(jié)果。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)對PAS染色陽性結(jié)果進行定量分析:每組隨機選取6只大鼠，每只大鼠選取10張肝組織切片，每張切片在10×40倍顯微鏡下選取視野，計算陽性產(chǎn)物面積占視野面積的比值，取平均值作為肝糖原含量的相對水平。

2 結(jié)果

2.1 絲膠對2型糖尿病大鼠血糖的影響 模型組大鼠的血糖水平明顯高于正常對照組大鼠(P＜0.01);絲膠治療組、陽性對照組、絲膠預(yù)防組大鼠的血糖水平均明顯低于糖尿病模型組大鼠(P＜0.01);且絲膠治療組、絲膠預(yù)防組與陽性對照組比較無明顯差別(P＞0.05)。見附表。結(jié)果表明，絲膠可明顯降低糖尿病模型大鼠的血糖水平。

2.2 絲膠對2型糖尿病大鼠肝糖原含量的影響 各組大鼠肝臟切片均可見PAS法肝糖原陽性產(chǎn)物，為紫紅色顆粒或細膩顆粒片狀聚集，位于肝細胞胞漿。糖尿病模型組大鼠肝糖原的含量明顯低于正常對照組大鼠(P＜0.01);絲膠治療組、陽性對照組、絲膠預(yù)防組大鼠肝糖原的含量均明顯高于糖尿病模型組大鼠(P＜0.01)，且絲膠治療組、絲膠預(yù)防組與陽性對照組比較無明顯差別(P＞0.05)。見附表。結(jié)果表明，絲膠可明顯增加2型糖尿病大鼠肝糖原的含量。

附表 各組大鼠的血糖和肝糖原含量(±s，n=12)

附表 各組大鼠的血糖和肝糖原含量(±s，n=12)

與糖尿病模型組比較:*P＜0.01;與陽性對照組比較:#P＞0.05

組別 血糖(mmol/L)肝糖原(面積百分比)正常對照組 10.83±2.03* 24.33±1.73*糖尿病模型組 29.45±4.82 12.21±2.27絲膠治療組 13.20±4.09*# 21.26±1.62*#陽性對照組 13.18±2.30* 21.18±1.39*絲膠預(yù)防組 10.04±2.29*# 23.81 ±2.71*#

3 討論

高血糖作為糖尿病的基本病理特征，也是引起慢性并發(fā)癥的重要原因，嚴格控制糖尿病患者的血糖水平，是避免引起糖尿病并發(fā)癥的關(guān)鍵。肝臟可通過促進糖原合成、葡萄糖利用及抑制糖異生等途徑降低血糖，是糖代謝的主要器官。肝臟的糖代謝作用主要在胰島素的誘導(dǎo)下完成，胰島素能夠抑制內(nèi)源性葡萄糖的產(chǎn)生以及刺激外周組織攝取葡萄糖，通過激活糖原合成酶磷酸酶，使糖原合成酶去磷酸化，從而提高糖原合成酶的活性，促進糖原的合成[4-6]。糖尿病時，胰島素對葡萄糖的氧化和非氧化作用的刺激均受損，其中非氧化受損明顯，肝糖原合成作為葡萄糖非氧化代謝的重要組成部分受到顯著影響[7]。四氧嘧啶糖尿病模型小鼠胰島素水平明顯降低，肝臟糖代謝紊亂，糖原合成降低、葡萄糖利用減少、糖異生加強，導(dǎo)致血糖升高[8-9]。本研究亦證實了這一點，糖尿病模型組大鼠肝糖原明顯減少，提示糖尿病大鼠肝細胞合成糖原的功能可能由于胰島素作用的減弱而受到損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，絲膠可顯著降低糖尿病模型大鼠的血糖水平，增加肝臟肝糖原的含量，表明絲膠可通過增加肝糖原的合成改善機體的高血糖狀態(tài)，其作用效果與陽性藥物二甲雙胍接近。由此推測，增加肝糖原含量可能是絲膠降血糖作用的機制之一，但增加肝糖原含量可能不是絲膠降血糖作用的唯一機制。因此，要全面了解絲膠降血糖的作用機制，還有待進一步研究。

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