郝明灼，馬 健，梁有旺，譚鵬鵬，彭方仁

葉片是植物的主要同化器官，生理功能較為活躍，對植物的光合、呼吸、水分代謝以及養(yǎng)分運輸?shù)壬砘顒佑兄苯佑绊?。葉綠體和線粒體是葉肉細胞中對環(huán)境條件變化最敏感的細胞器，其形態(tài)結(jié)構(gòu)、大小、數(shù)量和分布常常因環(huán)境條件變化而改變，在一定程度上可作為表征植物對逆境條件耐受性的依據(jù)［1－3］。

結(jié)合沿海防護林營造和城市園林建設(shè)的需要，近年來，國內(nèi)先后從北美引進了一些適應性和觀賞性相對較強的樹種，如美國白蠟(Fraxinus americana L.)、茶條槭(Acer ginnala Maxim.)、紅榿木(Alnus rubra Bong.)、水紫樹(Nyssa aquatica L.)和美國皂莢(Gleditsia triacanthos L.)等，并對這些引進樹種開展了耐澇、耐鹽和育苗技術(shù)等方面的研究［4－13］，但對不同濃度NaCl脅迫條件下這些樹種葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)的變化目前尚未見研究報道。

作者以上述5個樹種為研究對象，在人工氣候室內(nèi)用水培方法進行NaCl脅迫處理，采用透射電鏡技術(shù)對5個樹種葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)的變化進行了觀察比較，并在此基礎(chǔ)上分析了NaCl脅迫對5個樹種葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)的影響及其耐鹽能力，旨在為沿海地區(qū)的人工林營造及樹種選擇提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的美國皂莢、紅榿木、美國白蠟、茶條槭和水紫樹種子均引自北美，于2006年12月由中國種子進出口公司引進；于2007年3月播種，并種植于南京林業(yè)大學樹木園苗圃。實驗材料為1年生實生苗。

1.2 方法

1.2.1 NaCl脅迫處理方法 于2008年6月中旬在南京林業(yè)大學森林培育系人工氣候室中進行NaCl脅迫處理。選取生長狀況良好且長勢基本一致的各樹種幼苗，將根洗凈后移入盛有Hoagland營養(yǎng)液的水培箱(長44.5 cm、寬31.7 cm、高15.2 cm)中進行適應性培養(yǎng)，10 d后進行NaCl脅迫處理。共設(shè)置2個處理組和1個對照組，直接向Hoagland營養(yǎng)液中添加一定質(zhì)量的NaCl固體粉末并充分攪拌使溶液中NaCl的最終質(zhì)量濃度分別為4和8 g·L－1，對照為未添加NaCl固體粉末的 Hoagland營養(yǎng)液(0 g·L－1NaCl)。脅迫過程中，人工氣候室溫度為(25±1)℃、空氣相對濕度為(70±5)％、光照度1 500 lx、光照時間為12 h·d－1，每天早晚向處理液中補充氧氣各30 min。每個樹種每處理各5株幼苗，均重復3次。在NaCl脅迫處理的第3天，采集各樹種幼苗同一部位的3～5片功能葉用于制片。

1.2.2 透射電鏡樣品的制備與觀察 將葉片切成面積約1 mm2小塊，迅速用含質(zhì)量體積分數(shù)4％多聚甲醛和體積分數(shù)0.5％戊二醛的混合液(體積比9∶1，pH 7.2)固定，采用汪貴斌等［14］的方法依次進行洗滌、脫水、滲透、包埋、聚合、切片和染色，用H－600型透射電鏡(日本日立公司生產(chǎn))進行觀察并拍照。

2 結(jié)果和分析

2.1 正常條件(0 g·L－1 NaCl)下5個樹種葉肉細胞的超微結(jié)構(gòu)

在正常條件(0 g·L－1NaCl，對照)下，5個樹種葉肉細胞的超微結(jié)構(gòu)見圖1。在正常條件下，雖然各樹種葉肉細胞的超微結(jié)構(gòu)有一定差異，但它們的葉肉細胞均未發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象。美國白蠟葉肉細胞的葉綠體緊貼細胞壁排列，呈橢圓狀，且外膜完整；類囊體片層排列方向與長軸平行，含有少量且較大的嗜鋨顆粒；細胞核核膜清晰，染色質(zhì)分布均勻(圖1－1，2)。茶條槭葉肉細胞的葉綠體結(jié)構(gòu)完整，也緊貼細胞壁排列；類囊體片層排列規(guī)則，含有較多嗜鋨顆粒；細胞核正常(圖1－3，4)。紅榿木葉肉細胞的葉綠體結(jié)構(gòu)也很完整；類囊體片層無擴張現(xiàn)象；細胞核核膜完整，內(nèi)部染色質(zhì)分布均勻(圖1－5，6)。水紫樹葉肉細胞的葉綠體緊貼細胞壁排列，呈狹長的帶狀；類囊體片層結(jié)構(gòu)正常；細胞核核膜完整(圖1－7～9)。美國皂莢葉肉細胞的葉綠體也緊貼細胞壁排列；類囊體片層結(jié)構(gòu)完整，含有極少量嗜鋨顆粒且顏色較深；細胞核核膜清晰，染色質(zhì)無凝縮(圖1－10～12)。

2.2 經(jīng)4 g·L－1 NaCl脅迫處理后5個樹種葉肉細胞的超微結(jié)構(gòu)

經(jīng)4 g·L－1NaCl 脅迫處理3 d后，5個樹種葉肉細胞的超微結(jié)構(gòu)見圖2。與對照相比，5個樹種葉肉細胞的超微結(jié)構(gòu)均發(fā)生了一定的變化。美國白蠟葉肉細胞的葉綠體仍緊貼細胞壁排列，但略微腫脹；類囊體片層輕微擴張，嗜鋨顆粒數(shù)量增加；細胞核狀況與正常條件下的細胞核接近，但部分染色質(zhì)消失；葉肉細胞內(nèi)出現(xiàn)大量的環(huán)狀片層，但細胞未發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象(圖2－1～3)。茶條槭葉肉細胞的葉綠體也出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象，形狀接近于圓柱形；類囊體片層結(jié)構(gòu)不規(guī)則，嗜鋨顆粒數(shù)量增加；細胞核仍處于正常狀態(tài)；但葉肉細胞有輕微的質(zhì)壁分離現(xiàn)象(圖2－4，5)。紅榿木葉肉細胞的葉綠體也發(fā)生腫脹；類囊體片層呈擴張狀態(tài)，嗜鋨顆粒數(shù)量增多且顏色較淺；細胞核的部分核膜消失；葉肉細胞內(nèi)出現(xiàn)環(huán)狀片層，但細胞并未發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象(圖2－6～8)。水紫樹葉肉細胞的葉綠體也發(fā)生腫脹，葉綠體游離于細胞中央；類囊體片層結(jié)構(gòu)混亂，嗜鋨顆粒大量增加；細胞核內(nèi)的染色質(zhì)減少并發(fā)生凝聚；葉肉細胞內(nèi)出現(xiàn)環(huán)狀片層，且細胞發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象(圖2－9～11)。美國皂莢葉肉細胞的葉綠體出現(xiàn)腫脹變形，外膜部分消失，嗜鋨顆粒增大并增多；細胞核的部分核膜消失、染色質(zhì)減少并開始凝聚到核膜邊緣；細胞發(fā)生輕微的質(zhì)壁分離現(xiàn)象(圖2－12)。

圖1 正常條件下(0 g·L－1 NaCl)5個樹種幼苗葉肉細胞的超微結(jié)構(gòu)Fig.1 The ultrastructure ofmesophyll cells of seedlings of five tree species under normal condition(0 g·L－1 NaC l)

2.3 經(jīng)8 g·L－1 NaCl脅迫處理后5個樹種葉肉細胞的超微結(jié)構(gòu)

圖2 經(jīng)4 g·L－1 NaCl脅迫處理后5個樹種幼苗葉肉細胞的超微結(jié)構(gòu)Fig.2 The ultrastructure ofmesophyll cells of seed lings of five tree species after stressed w ith 4 g·L－1 NaCl

經(jīng)8 g·L－1NaCl脅迫處理3 d后，5個樹種葉肉細胞的超微結(jié)構(gòu)見圖3。與對照及4 g·L－1NaCl脅迫處理組相比，經(jīng)8 g·L－1NaCl脅迫處理后5個樹種葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)的變化更明顯。美國白蠟葉肉細胞葉綠體的類囊體片層擴張程度更大且排列不規(guī)則；細胞核內(nèi)染色質(zhì)減少，部分核膜受損；但細胞未發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象(圖3－1)。茶條槭葉肉細胞的葉綠體嚴重腫脹；類囊體片層排列不規(guī)則，嗜鋨顆粒增大且顏色加深；細胞核內(nèi)染色質(zhì)嚴重凝聚，核膜破裂；細胞的質(zhì)壁分離現(xiàn)象更明顯(圖3－2)。紅榿木葉肉細胞的葉綠體也發(fā)生腫脹；類囊體片層排列較規(guī)則，嗜鋨顆粒增多；細胞核內(nèi)染色質(zhì)較少，核膜消失但仍有環(huán)狀片層；細胞未發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象(圖3－3，4)。水紫樹葉肉細胞的葉綠體破裂，結(jié)構(gòu)嚴重受損；嗜鋨顆粒增大并增多，且部分嗜鋨顆粒變空；細胞核內(nèi)染色質(zhì)凝縮嚴重，核膜破裂；細胞發(fā)生嚴重的質(zhì)壁分離現(xiàn)象(圖3－5，6)。美國皂莢葉肉細胞的葉綠體外膜破裂，嗜鋨顆粒增大并增多；細胞核嚴重降解并凝聚到核膜附近，細胞的質(zhì)壁分離現(xiàn)象更加嚴重(圖3－7，8)。

3 討論和結(jié)論

經(jīng)過不同質(zhì)量濃度NaCl脅迫處理后5個樹種葉肉細胞的超微結(jié)構(gòu)均有一定的變化，但葉肉細胞內(nèi)各細胞器對NaCl脅迫的敏感性和耐受性不同，其中葉綠體和細胞核對NaCl脅迫較敏感。葉綠體是植物細胞產(chǎn)生活性氧的重要細胞器，在正常情況下，葉綠體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，葉綠體內(nèi)的SOD可將超氧陰離子自由基歧化為H2O2，并主要通過AsA－GSH循環(huán)途徑清除H2O2［1，15］。脅迫環(huán)境可導致葉綠體中H2O2的積累，H2O2通過Haber－Weiss反應產(chǎn)生攻擊力更強的羥自由基，并啟動膜脂過氧化反應，致使膜脂和膜蛋白遭到破壞，從而影響細胞膜結(jié)構(gòu)［16－17］。本研究結(jié)果表明：隨NaCl脅迫程度的加強，葉肉細胞中葉綠體結(jié)構(gòu)受到不同程度的破壞，葉綠體發(fā)生腫脹、外膜破裂、類囊體片層結(jié)構(gòu)混亂，這些特征與賈恢先等［18］和殷秀杰等［19］的研究結(jié)果相似。

圖3 經(jīng)8 g·L－1 NaCl脅迫處理后5個樹種幼苗葉肉細胞的超微結(jié)構(gòu)Fig.3 The ultrastructure ofmesophyll cells of seed lings of five tree species after stressed w ith 8 g·L－1 NaCl

細胞核也是植物細胞內(nèi)的重要細胞器之一，是遺傳信息儲存、復制、表達的主要場所。有學者認為細胞核的變形和核膜的內(nèi)折會影響基因的表達和細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成及細胞分化［20－21］。NaCl脅迫條件下，細胞核最明顯的受害特征是核染色質(zhì)凝聚，這種現(xiàn)象會造成細胞器功能與結(jié)構(gòu)的缺陷，直接影響細胞活動。本研究結(jié)果表明：在NaCl質(zhì)量濃度較低(4 g·L－1)的條件下，葉肉細胞的細胞核結(jié)構(gòu)基本維持正常，僅少量染色質(zhì)減少；而在NaCl質(zhì)量濃度較高(8 g·L－1)的條件下，細胞核內(nèi)染色質(zhì)發(fā)生凝聚，并聚集至核膜附近。推測染色質(zhì)的凝聚可能是由于NaCl脅迫改變了細胞核內(nèi)生物大分子(如核酸)的結(jié)構(gòu)等，從而在分子水平上造成DNA損傷，對細胞核造成不可逆的損害［22－23］。

在NaCl脅迫過程中，紅榿木、美國白蠟和水紫樹的葉肉細胞中均產(chǎn)生了環(huán)狀片層。吳曉東等［24］在薺菜〔Capsella bursa-pastoris(L.)Medic.〕胚細胞和胚柄細胞中均發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀片層，指出環(huán)狀片層是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種存在類型，由2～100個片層結(jié)構(gòu)平行排列成弧狀或同心圓狀；并認為環(huán)狀片層可能與細胞分裂、細胞增殖、細胞對損傷的保護性反應有關(guān)。而在本研究供試的5個樹種的葉肉細胞中，環(huán)狀片層出現(xiàn)在NaCl脅迫之后，說明細胞中的環(huán)狀片層可能是植物細胞對損傷的保護性反應，與植物的抗逆性機制密切相關(guān)，但其功能還有待于進一步研究確認。

趙曼容等［25］認為：嗜鋨顆粒是脂類物質(zhì)和鋨酸的聚合物，它的產(chǎn)生一方面是由于類囊體降解以及降解脂質(zhì)聚集的結(jié)果，可作為植物遭受損害程度的鑒定指標；另一方面，在同一脅迫條件下，嗜鋨顆粒越多，表明植物體內(nèi)的脂類物質(zhì)越多，對膜結(jié)構(gòu)完整性和植物重要器官進行正常代謝活動的保護能力越強，所以，嗜鋨顆粒還能作為判斷植物抗逆性能力的指標。在本研究中，隨NaCl脅迫程度的增強，5個樹種葉肉細胞受破壞程度加劇，類囊體片層結(jié)構(gòu)中嗜鋨顆粒明顯增多，與汪貴斌等［14］和葛秀秀等［26］的研究結(jié)果基本一致。

細胞器和膜結(jié)構(gòu)的破壞是植物受到鹽害的共同特征，破壞程度取決于植物耐鹽性的強弱。一般來說，耐鹽性強的種類，其細胞膜系統(tǒng)及細胞器的穩(wěn)定性均較高，受破壞的程度較?。?］。在8 g·L－1NaCl脅迫條件下，紅榿木葉肉細胞的細胞器最穩(wěn)定，未發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象；美國白蠟的葉肉細胞盡管核膜部分受損但并未發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象；美國皂莢和茶條槭葉肉細胞膜系統(tǒng)的破壞程度不大，僅有輕微的質(zhì)壁分離現(xiàn)象；而水紫樹葉肉細胞的細胞膜系統(tǒng)破壞程度較嚴重，在NaCl質(zhì)量濃度較低(4 g·L－1)的條件下質(zhì)壁分離現(xiàn)象就較為明顯。因而，紅榿木和美國白蠟對NaCl脅迫的耐性相對較強，美國皂莢和茶條槭也有一定的耐性，水紫樹對NaCl脅迫的耐性最弱。

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