田可港， 浮 苗， 高 艷， 彭 穎， 李 祥， 鄭曉群△， 徐志偉， 宋建華， 呂建新

(1溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院實驗診斷中心，浙江 溫州325027;2溫州醫(yī)學院浙江省醫(yī)學遺傳學重點實驗室，浙江 溫州325035;3俄克拉荷馬醫(yī)學研究中心，美國 俄克拉荷馬73104)

人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是皰疹病毒科屬的DNA 病毒，具有嚴格的種屬特異性。1960 年，Weller 等鑒于病毒感染細胞后所呈現(xiàn)細胞明顯增大的特征及該病毒在巨細胞包涵體病中的作用，將該病毒命名為巨細胞病毒。1973 年，國際病毒命名委員會(ICNV)皰疹病毒組將此病毒正式命名為人類皰疹病毒5 型(human herpes virus 5，HHV- 5)。在免疫正常個體，HCMV 的初發(fā)感染常無癥狀，當宿主免疫功能不全或免疫功能減弱時，HCMV 的原發(fā)感染或潛伏再激活感染會引起嚴重的乃至威脅生命的疾病［1-2］。cmvIL - 10 是HCMV UL111A 基因編碼的由175 個氨基酸組成的蛋白質，功能與人IL -10(hIL -10)類似。既往研究表明，HCMV 潛伏感染時，UL111A 基因不表達cmvIL -10，激活感染時表達cmvIL -10［3-6］。因此我們推測，cmvIL-10 可能參與HCMV 潛伏及再激活感染的過程。人轉錄因子GATA -1 由413 個氨基酸組成，含2 個鋅指結構，即C -鋅指和N -鋅指，可通過與基因啟動子中的(A/T)GATA(A/G)模序結合激活基因轉錄。本研究通過染色質免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)方法研究轉錄因子GATA-1 與UL111A 基因5'上游DNA 序列的相互作用，探討二者在HCMV 潛伏及再激活感染中可能發(fā)揮的作用。

材 料 和 方 法

1 主要材料

HCMV AD169 株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，人白血病單核細胞(THP-1 細胞)購于中科院上海細胞庫，GATA -1 兔抗人抗體購于Abcam，TaKa-Ra 公司合成PCR 引物，ChIP 試劑盒購自Upstate，細胞核蛋白提取試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

2 HCMV 潛伏感染和激活感染細胞模型建立及分組

2.1 細胞感染模型建立 THP -1 細胞于Gibco 常規(guī)RPMI-1640 培養(yǎng)液，10%特級胎牛血清，1 ×105U/L 青霉素，100 mg/L 鏈霉素，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HCMV AD169 株以感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=1 感染THP -1 細胞(1 ×109/L)。100 μg/L 12 -肉豆蒄酸-13 -乙酸佛波酯(phorbol 12 -myristate 13 -acetate，PMA)刺激HCMV 潛伏感染的THP -1 細胞，細胞置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h 和96 h 后，分別提取細胞總RNA，RT -PCR 檢測HCMV UL123 基因和UL82 基因的表達。UL123 基因表達調節(jié)蛋白IE，設計上游引物序列為5'-CAAGAG AAAGATGGACCCTG - 3'，下游引物序列為5' -CGAGTTCTGCCAGGACATC - 3'，目的擴增片段為242 bp;UL82 基因表達被膜蛋白pp65，設計上游引物序列為5'-TGCCCTGGATGCGATACTG -3'，下游序列引物為5'-AGGACCTGACGATGACCCG -3'，目的擴增片段為378 bp，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR 擴增條件:94 ℃預變性5 min，94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個循環(huán)后72 ℃10 min，擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳。同時，實時熒光定量PCR 檢測細胞內HCMV DNA 載量，透射電鏡觀察THP-1 細胞內病毒顆粒。根據(jù)上述指標，綜合判斷病毒感染狀態(tài)。

2.2 實驗分組 HCMV AD169 株以MOI =1 感染THP-1 細胞(1 ×109/L)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h 后作為潛伏感染組;100 μg/L PMA 刺激HCMV 潛伏感染的THP -1 細胞，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h 后作為激活感染組;對照組加入相同量的DMEM 培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h。

3 RT－PCR 分析HCMV 潛伏及再激活感染時cmvIL－10 的表達

Trizol 法提取HCMV 潛伏及再激活感染96 h 后細胞總RNA，并逆轉錄為cDNA。應用Primer Premier 5.0 軟件設計cmvIL - 10 及內參照GAPDH 的PCR 引物，cmvIL - 10 上游引物5' - GGGGAATTCATGCTGTCGGTGATGGTCT - 3'，下游引物5' -ACATTGCCGCATGTCTTTG-3'，目的擴增片段為381 bp;GAPDH 上游引物5' - GAGTCAACGGATTTGGTCGT - 3'，下游引物5' - GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，目的擴增片段為185 bp。PCR 擴增條件:94 ℃預變性5 min，94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個循環(huán)后72 ℃10 min，擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳。

4 Western blotting 檢測轉錄因子GATA－1 的表達

利用細胞核蛋白提取試劑盒提取對照組，HCMV潛伏感染組和激活感染組核蛋白，然后進行Western blotting 檢測，利用ImageJ 軟件分析條帶的灰度值，目的條帶與內參照條帶灰度值的比值表示GATA-1的相對表達量。

5 HCMV UL111A 5’上游序列GATA－1 結合部位的生物信息學預測分析

應用TRANSFAC 數(shù)據(jù)庫中的MATCH 工具對HCMV UL111A 5’上游序列轉錄因子GATA-1 結合位點進行預測，采用TRANSFAC Professional 9.4 庫中的單核苷酸加權模型集對每個位點進行打分，通過每個位點所得分數(shù)(0 ～1)來確定轉錄因子結合情況，從中選出轉錄因子GATA -1 對應的結合位點，見表1，并設計合成相應的ChIP-PCR 引物，見表2。GATA - 1 結合序列預測分析和引物設計時選用HCMV AD169 株全基因序列RefSeq FJ527563. 1，HCMV UL111A 5’上游序列堿基起止位為155 755 ～160 632。

6 ChIP－PCR 試驗

采用Upstate 公司的ChIP 試劑盒處理HCMV 潛伏與激活感染組細胞，操作步驟如下:加入37%甲醛體外交聯(lián)和裂解細胞DNA，超聲處理(功率500W，超聲7s，停10s，重復3 次)DNA，使交聯(lián)的DNA/蛋白質共沉淀，洗脫DNA/蛋白質復合物，解交聯(lián)，純化DNA。在交聯(lián)的DNA/蛋白質共沉淀過程中，分為input 和IP 組，input 組不加入GATA -1 抗體，IP 組加入GATA-1 抗體。嚴格按照ChIP 試劑盒說明書操作。

表1 轉錄因子GATA－1 結合位點的預測結果Table 1. The predicted results of binding sites of transcription factor GATA-1

表2 GATA－1 的預測結合位點設計的引物Table 2. The primers based on the predicted binding sites of transcription factor GATA-1

將各組得到的DNA 產(chǎn)物分別加入上述引物進行PCR 擴增，反應體系如下:10 ×Ex Taq buffer 2.5 μL，2. 5 mmol/L dNTP 2. 5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，20 μmol/L 上、下游引物各0.5 μL，DNA 2 μL，5 U/μL Taq 酶0.125 μL，加ddH2O 至25 μL。反應條件如下:94 ℃預變性5 min，繼而94 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個循環(huán)后72 ℃10 min，擴增產(chǎn)物用1.5% 的瓊脂糖凝膠進行電泳。實時熒光定量PCR 反應體系如下:SYBR Premix Ex TaqTM(2 ×)10 μL，20 μmol/L 上、下游引物0. 4 μL，DNA 2 μL，ROX Reference Dye 0.2 μL，加ddH2O 至20 μL。反應條件:94 ℃預變性5 min，繼而94 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個循環(huán)后72 ℃10 min，AB7500熒光定量PCR 儀檢測。以-ΔCt 值來表示HCMV 潛伏與激活感染時轉錄因子GATA-1 與UL111A 5’上游各位點的結合率，ΔCt 為IP 組與input 組的Ct 差值(CtIP-Ctinput)。

7 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，兩組間均數(shù)比較采用兩樣本t 檢驗，多組數(shù)據(jù)采用方差分析，以P ＜0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 HCMV 潛伏及再激活感染細胞模型的建立

1.1 HCMV 潛伏感染細胞模型的建立 HCMV AD169 株感染THP -1 細胞96 h 后，透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞內有病毒顆粒，見圖1。HCMV UL123 基因PCR 擴增片段為242 bp，表達量隨著時間的增加逐漸減少;未檢測到HCMV UL82 基因的表達，見圖2。

Figure 1. Electron micrographs of HCMV - infected THP - 1 cells (×50 000).The arrows indicate the viral particles.圖1 HCMV 感染THP－1 細胞電鏡圖

Figure 2. The expression of HCMV UL82 and UL123 genes in HCMV-infected THP-1 cells.M:DL2000 marker.圖2 HCMV 感染THP－1 細胞96、72、48、24 及12 h 后UL123 和UL82 基因的表達

1.2 HCMV 再激活感染細胞模型的建立 PMA 刺激HCMV 潛伏感染細胞96 h 后，懸浮生長的THP -1 細胞轉為貼壁生長，電鏡觀察細胞內出現(xiàn)較多病毒顆粒，見圖3。HCMV UL123 基因表達量先隨著時間的增加而增加，后逐漸減少，UL82 基因PCR 擴增片段為378 bp，96 h 時檢測到表達，見圖4。

Figure 3. Electron micrograph of an HCMV -latently -infected cell stimulated by PMA(×30 000). The arrows indicate the viral particles.圖3 PMA 刺激HCMV 潛伏感染細胞電鏡圖

Figure 4. The expression of HCMV UL123 and UL82 genes in HCMV - reactivatedly - infected cells. M:100 bp DNA ladder marker.圖4 HCMV 再激活感染THP－1 細胞96、72、48、24 及12 h后UL123 和UL82 基因表達

2 HCMV 潛伏與再激活感染時UL111A 的表達

HCMV 潛伏感染時，RT-PCR 未擴增出UL111A基因表達的cmvIL-10，再激活感染時表達cmvIL -10，擴增片段為381 bp，見圖5。

Figure 5. RT - PCR amplification results of cmvIL -10. 1，3:HCMV reactivated and latent infection，respectively;2，4:GAPDH;M:100 bp DNA ladder marker圖5 cmvIL－10 mRNA RT－PCR 擴增結果

3 Western blotting 分析HCMV 潛伏及再激活感染時轉錄因子GATA－1 的表達

HCMV 潛伏及再激活感染后，分別提取感染的細胞核內蛋白進行Western blotting 檢測，HCMV 潛伏與激活感染后均檢測到轉錄因子GATA -1 表達，見圖6。同時，HCMV 潛伏感染組轉錄因子GATA -1 的相對表達量(1. 13 ± 0. 08)高于激活感染組(0.51 ±0.11)，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。

4 HCMV 潛伏及再激活感染時ChIP 結果分析

以input 組和IP 組DNA 為模板，用預測的結合位點所設計的9 對引物進行PCR 擴增，結果顯示5對引物(GATA -12 引物、GATA -21 引物、GATA -22 引物、GATA-23 引物和GATA -26 引物)均擴增出目的條帶，擴增片段分別為202 bp、208 bp、250 bp、245 bp 和198 bp，見圖7、8，其對應的轉錄因子GATA-1 結合位點分別是1119(-3760)位點、107(-4772)位點、609(-4270)位點、849(-4030)位點和2047(-2832)位點，見圖9。前面位點為分析獲得，括號內位點為根據(jù)規(guī)定算得。

Figure 6. The expression of transcription factor GATA-1 in HCMV latent and reactivated infection.1:control group;2:HCMV latent infection group;3:HCMV reactivated infection group. ±s. n =3. * P ＜0.05 vs HCMV latent infection group.圖6 Western blotting 分析HCMV 潛伏及再激活感染時轉錄因子GATA－1 表達

用上述5 對引物進行熒光定量PCR，結果顯示HCMV 再激活感染組轉錄因子GATA -1 與UL111A基因5’端上游序列5 個位點的結合率(-1.13 ±0.07、-0.63 ±0.05、-1.10 ±0.07、-0.24 ±0.03和-0. 14 ± 0. 01)均高于潛伏感染組(- 4. 00 ±0.26、-4.50 ±0.33、-4.41 ±0.21、-3.61 ±0.20和-3.47 ±0.11)。經(jīng)兩樣本t 檢驗，5 個結合位點轉錄因子GATA -1 的結合率差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見圖10。

討 論

Figure 7. PCR product electrophoresis of HCMV latent infection after ChIP.A and B was input group and antibody treatment group，respectively.1:negative control group;2 ～6:amplified products of 1119(-3760)site，107(-4772)site，609(-4270)site，849(-4030)site and 2047(-2832)site，respectively;M:100 bp DNA ladder marker.圖7 HCMV 潛伏感染時ChIP 處理后PCR 產(chǎn)物電泳圖

Figure 8. PCR product electrophoresis of HCMV reactivated infection after ChIP. A and B was input group and antibody treatment group，respectively.1:negative control group;2 ～6:amplified products of 1119(-3760)site，107(-4772)site，609(-4270)site，849(-4030)site and 2047(-2832)site，respectively;M:100 bp DNA ladder marker.圖8 HCMV 激活感染時ChIP 處理后PCR 產(chǎn)物電泳圖

Figure 9. The binding sites of transcription factor GATA-1 on 5 'upstream DNA sequence of UL111A gene.圖9 HCMV UL111A 基因5’端上游核酸序列轉錄因子GATA－1 的結合位點

Figure 10. Comparison of transcription factor GATA -1 binding rates in latent and reactivated infection.1 ～5:1119(-3760)site，107(-4772)site，609(-4270)site，849(-4030)site and 2047(-2832)site，respectively. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs HCMV latent infection.圖10 HCMV 潛伏及再激活感染時轉錄因子GATA－1 結合率的比較

目前認為，單核細胞和髓系早期細胞是HCMV潛伏感染的主要細胞，一旦分化為巨噬細胞或樹突狀細胞，病毒的早期基因表達就會被激活，HCMV 可由潛伏感染向再激活轉化［7-10］。然而，HCMV 病毒由潛伏狀態(tài)向再激活轉化的機制還缺乏更深入的研究。HCMV 具有高度種屬特異性，不能用動物模型對其直接進行研究;在健康攜帶者的外周血和骨髓細胞中，被潛伏感染的細胞所占的比例很少，僅為0.004% ～0.010%，且在每個被潛伏感染的細胞中約含有2 ～13 個病毒基因組DNA，難以滿足當前研究的需求。雖然有很多針對CMV 的模型，由于HCMV具有高度的種屬特異性，針對CMV 的模型不能用于HCMV 的研究。因此，我們參考國內外的研究建立了HCMV 潛伏及再激活感染的THP-1 細胞模型。

HCMV 潛伏感染時，UL111A 基因不表達cmvIL-10，激活感染時表達cmvIL -10。我們對UL111A 5’端上游約5.0 kb 的序列進行了生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)其中交錯分布著轉錄因子GATA -1 的結合位點，由此推測轉錄因子GATA -1 可能參與了HCMV潛伏及再激活感染過程。本研究中，我們證實了HCMV 潛伏感染時，UL111A 基因不表達cmvIL -10，激活感染時表達。同時，Western blotting 分析結果表明HCMV 潛伏感染時轉錄因子GATA -1 的表達量高于再激活感染時，這可能與GATA -1 抑制單核細胞的分化有關。

染色質免疫沉淀［11］是體內研究蛋白質與DNA相互作用強有力的方法，此方法不需要分別提取核酸或蛋白，在天然的染色質環(huán)境下進行，基本保持了二者在細胞內的真實結合狀態(tài)。本實驗中，通過GATA-1 抗體，特異性將超聲打斷的DNA -GATA-1 復合物小片段免疫沉淀，并純化解交聯(lián)，獲得GATA-1 結合的DNA 片段，對純化獲得的DNA 片段進行PCR 擴增鑒定。結果表明，轉錄因子GATA-1 可與UL111A 5’端上游序列107(-4772)位點、609 (- 4270)位點、849 (- 4030)位點、1119(-3760)位點和2047(-2832)位點共5 個位點結合，且激活感染時轉錄因子GATA-1 的結合率高于潛伏感染。我們推測HCMV 激活感染后轉錄因子GATA-1 可能通過與UL111A 基因5’上游序列結合位點的結合，啟動cmvIL-10 的轉錄，參與HCMV 再激活感染的過程。本文研究結果僅是初步的探索性結果，應做進一步的驗證性研究，如用報告基因技術等。更深入地研究GATA -1 如何與UL111A 基因5’上游序列潛在結合位點作用，不同位點的缺失是否影響GATA-1 的調控功能，哪個位點是GATA-1的關鍵結合區(qū)域，是否存在其它的核轉錄因子或共調控蛋白作用這些區(qū)域?相信隨著這些問題的逐步闡明，將有利于更全面地理解在轉錄水平HCMV 潛伏及再激活感染的調控機制。

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