余海浪， 劉安玲， 周玨宇， 孟 偉， 鄭文嶺， 馬文麗△

(1南方醫(yī)科大學基因工程研究所，廣東 廣州510515;2華南基因組研究中心，廣東 廣州510800)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，遠處轉(zhuǎn)移已 成為乳腺癌患者死亡的主要原因。Ⅰ型膠原α1 鏈(collagen type I alpha 1，COL1A1)是細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的重要組成成分，對細胞的黏附和分化有重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，COL1A1 基因在乳腺導管癌和乳腺小葉癌中均有不同程度的高表達，并且可能與乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移存在一定相關(guān)性［1-2］。RNA 干擾(RNA interference，RNAi)是一種由雙鏈RNA(dsRNA)介導的基因表達抑制途徑，具有高效性、高穩(wěn)定性和高特異性的優(yōu)點［3-4］，近來已經(jīng)在功能基因組學研究和基因治療方面取得了巨大進展［5-7］。本研究利用靶向COL1A1 的特異性siRNA 真核表達載體pshRNA-COL1A1，瞬時轉(zhuǎn)染人乳腺癌細胞MDA -MB -231，探討pshRNA -COL1A1重組質(zhì)粒對細胞體外增殖及凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

人乳腺癌細胞系MDA -MB -231 由本研究所保存;pSilencer2.1 - U6 - COL1A1(以下簡稱pshRNA-COL1A1)重組質(zhì)粒由本實驗室前期構(gòu)建;LipofectamineTM2000 購自Invitrogen;胎牛血清購自杭州四季青公司;RPMI -1640 培養(yǎng)基購自Gibco;MTT、Hoechst 33258 和PI 均購自Sigma;PrimeScript RT reagent Kit 購自TaKaRa;COL1A1 鼠抗人多克隆抗體、兔抗人β-actin 單克隆抗體購自Santa Cruz;HRP 標記的羊抗鼠IgG 和HRP 標記的羊抗兔IgG 購自北京中山公司;Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) MDA-MB-231 細胞用含10%胎牛血清、無抗生素的RPMI -1640 培養(yǎng)基、37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。觀察細胞生長情況，每2 ～3 d 用胰酶消化，傳代培養(yǎng)。

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 當貼壁細胞匯合達90% ～95%，用無血清培養(yǎng)基洗3 次，將細胞分為脂質(zhì)體對照組(mock)、空載體組(empty vector)、陰性對照組(scrambled)及重組質(zhì)粒處理組(pshRNA -COL1A1)。參照LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，72 h 后收集細胞分別用蛋白裂解液及Trizol試劑提取總蛋白及總RNA 備用。

2.3 半定量RT -PCR 檢測COL1A1 mRNA 表達水平 取上述總RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄，PCR 擴增COL1A1和內(nèi)參照β-actin。COL1A1 引物序列:正義鏈5’-CGATGGATTCCAGTTCGAGT - 3’，反義鏈5’-TTTTGAGGGGGTTCAGTTTG-3’，擴增片段長度496 bp;反應條件:94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃60 s，30個循環(huán)后，72 ℃5 min。

2.4 Western blotting 檢測COL1A1 蛋白表達水平

取上述總蛋白進行SDS - PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后NC 膜依 次 與COL1A1 Ⅰ抗(1 ∶200)、β - actin(1∶1 000)、羊抗鼠IgG/HRP 及羊抗兔IgG/HRP 孵育，常規(guī)曝光，顯影定影，直至顯示出電泳帶，用凝膠掃描成像系統(tǒng)進行半定量分析。

2.5 MTT 檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的各組細胞，用含10%胎牛血清的RPMI -1640 制成細胞懸液，以每孔1 ×104個細胞接種于96 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，分別在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h 和168 h 后，每孔加入5 g/L MTT 溶液20 μL，振蕩混勻，避光狀態(tài)下37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng);棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液后，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min 溶解結(jié)晶。酶標儀檢測570 nm 波長吸光度A 值，每組5 個復孔，實驗重復3 次。

2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 取對數(shù)生長期的各組細胞，用PBS 制成單個細胞懸液;加預冷的75%乙醇，快速混勻，4 ℃固定1 h;PBS 洗滌3 次，每次加PBS 2.5 mL，1 000 r/min 離心5 min;調(diào)整細胞濃度，每份樣品細胞數(shù)目約為5 ×105;加入50 μL RNase(10 mg/L)和200 μL PI(5 mg/L)，室溫下避光染色30 min;檢測前，細胞經(jīng)300 目濾網(wǎng)過濾;流式細胞儀進行細胞周期檢測，用Cell Quest 軟件收取細胞(每份樣品至少取1 ×104個細胞)，并分析細胞周期，結(jié)果以細胞周期各時相細胞的百分率表示。

2.7 細胞凋亡的形態(tài)學觀察( Hoechst 33258 染色)

收集處理組細胞及對照組細胞(1 ×109/L)，均勻滴至載波片上并用濾紙吸去多余液體，干燥。滴加50%固定液(3∶1 甲醇/乙酸)固定15 min，用PBS 洗2 次，室溫下再用1 mg/L Hoechst 33258 染液避光染色10 min，再用PBS 洗2 次。染色后的細胞在激發(fā)波長348 nm/發(fā)射波長480 nm 的紫外熒光顯微鏡下觀察。

2.8 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡( Annexin V -FITC/PI 染色法) 取對數(shù)生長期的各組細胞，用PBS 制成單個細胞懸液;PBS 洗滌3 次，每次加PBS 2. 5 mL，1 000 r/min 離心5 min;調(diào)整細胞濃度，約取5 ×105個細胞重懸于1 mL 1 ×binding buffer;取100 μL懸液，加5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，室溫反應15 min;加400 μL 1 ×binding buffer，上流式細胞儀測定熒光含量。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，組間差異用單因素方差分析，組間多重比較用LSD 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 特異性pshRNA－COL1A1 抑制MDA－MB－231 細胞COL1A1 mRNA 表達

RT-PCR 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pshRNA -COL1A1 重組質(zhì)粒的細胞COL1A1 mRNA 顯著低于陰性對照組(P ＜0.05)，抑制率為63.05% ±3.13%，而陰性對照與脂質(zhì)體組比較無顯著差異(P ＞0.05)，見圖1。

Figure 1. The results of RT -PCR analysis of COL1A1 mRNA expression in MDA-MB -231 cells. ±s. n =3. * P＜0.05 vs mock or scrambled group.圖1 RT－PCR 檢測pshRNA－COL1A1 轉(zhuǎn)染后乳腺癌MDA－MB－231 細胞COL1A1 mRNA 的表達

2 特異性pshRNA－COL1A1 抑制MDA－MB－231 細胞COL1A1 蛋白表達

Western blotting 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 pshRNA -COL1A1 重組質(zhì)粒的細胞中COL1A1 蛋白抑制率為66.98% ±2.08%，顯著高于脂質(zhì)體對照組和陰性對照組(P ＜0.05)，見圖2。

Figure 2. The results of Western blotting analysis of COL1A1 protein expression in MDA -MB -231 cells. ±s. n=3. * P ＜0.05 vs mock or scrambled group.圖2 Western blotting 檢測pshRNA－COL1A1 轉(zhuǎn)染后乳腺癌MDA－MB－231 細胞COL1A1 蛋白的表達

3 特異性pshRNA－COL1A1 抑制MDA－MB－231 細胞的生長

用MTT 法檢測24 h ～168 h 細胞的生長狀況，發(fā)現(xiàn)pshRNA-COL1A1 轉(zhuǎn)染組細胞增殖減慢，除24 h外，其余各時點A 值均顯著低于陰性對照及脂質(zhì)體對照(P ＜0.05)，并呈時間依賴性，見表1。而陰性對照與脂質(zhì)體對照組細胞體外增殖活性無明顯差異(P ＞0.05)。

表1 MTT 法檢測pshRNA－COL1A1 對MDA－MB－231 細胞增殖的影響Table 1. The effect of pshRNA-COL1A1 on the proliferation of MDA-MB-231 cells detected by MTT assay (A570. ±s.n=5)

表1 MTT 法檢測pshRNA－COL1A1 對MDA－MB－231 細胞增殖的影響Table 1. The effect of pshRNA-COL1A1 on the proliferation of MDA-MB-231 cells detected by MTT assay (A570. ±s.n=5)

* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs mock or scrambled group.

Group 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h Mock 0.29±0.02 0.51±0.01 1.24±0.05 1.47±0.0 4 1.65±0.18 2.16±0.17 2.52±0.12 Scrambled 0.28±0.02 0.49±0.02 1.07±0.10 1.39±0.08 1.64±0.10 2.13±0.16 2.49±0.28 shRNA-COL1A1 0.27±0.01 0.41±0.03* 0.64±0.05＊＊ 1.16±0.12* 1.32±0.06* 1.48±0.07＊＊ 1.67±0.11＊＊

4 特異性shRNA－COL1A1 對MDA－MB－231細胞周期的影響

流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期的變化，見圖3、表2。與脂質(zhì)體組和陰性對照組細胞比較，pshRNA -COL1A1 轉(zhuǎn)染組G0/G1期細胞數(shù)顯著增多，S 期細胞數(shù)顯著減少(P ＜0.05)，細胞明顯阻滯于G0/G1期。

Figure 3. Detection of cell cycle of cells of each grounp by flow cytometry. A:mock;B:scrambled;C:pshRNA-COL1A1.圖3 流式細胞術(shù)檢測各組細胞的細胞周期

表2 流式細胞術(shù)檢測各組細胞的細胞周期和凋亡Table 2. The flow cytometry detection results of MDA - MB -231 cell cycle and apoptosis (±s.n=3)

表2 流式細胞術(shù)檢測各組細胞的細胞周期和凋亡Table 2. The flow cytometry detection results of MDA - MB -231 cell cycle and apoptosis (±s.n=3)

* P ＜0.05 vs mock or scrambled group.

Group Apoptotic cells(%) G0/G1(%) S(%) G2/M(%)1.14 Scrambled 4.72±0.78 54.18±3.47 26.56±2.54 19.27±3.97 pshRNA-COL1A1 13.29±0.43* 63.98±2.94* 15.40±3.71*Mock 3.43±0.52 53.53±1.98 30.25±2.74 16.22±20.62±0.99

5 細胞凋亡的形態(tài)學觀察

用Hoechst 33258 對MDA -MB -231 細胞進行活細胞熒光染色，結(jié)果如圖4 所示。脂質(zhì)體組和陰性對照組細胞呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)均勻分布，細胞核熒光較弱，且著色均勻。pshRNA -COL1A1 組細胞核固縮、核染色質(zhì)濃縮，箭頭所示細胞在形態(tài)學上出現(xiàn)明顯的凋亡特點，表現(xiàn)為核濃染致密的顆粒塊狀熒光或碎片樣熒光。

6 特異性shRNA－COL1A1 對MDA－MB－231細胞凋亡的影響

各組轉(zhuǎn)染72 h 后，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pshRNA-COL1A1 組的細胞凋亡率顯著高于脂質(zhì)體對照組和陰性對照組(P ＜0. 05)，見表2、圖5。

討 論

ECM 是腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的天然屏障，腫瘤細胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移，必須以運動功能為動力，穿透ECM。COL1A1 基因全長17 537 bp，含有51 個外顯子，位于染色體17q21.33，編碼I 型膠原纖維的前α1鏈，COL1A2 基因編碼α2 鏈。I 型膠原纖維前體是由2 條α1 鏈和1 條α2 鏈形成的三聚體結(jié)構(gòu)，是ECM的重要組成成分，對細胞的黏附、分化有重要作用。I 型膠原纖維主要存在于人體的結(jié)締組織中，在骨組織、皮膚中含量較多［8］。近年來有報道稱，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中存在COL1A1 基因的異常表達，并且可能與腫瘤細胞的增殖和遷移及腫瘤的預后相關(guān)［1-2，9-11］。

本研究通過shRNA 抑制COL1A1 基因的表達后，對體外培養(yǎng)的MDA -MB -231 細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡的影響。RT -PCR、Western boltting等證實上述質(zhì)粒可在mRNA 及蛋白質(zhì)水平顯著抑制COL1A1 表達，腫瘤細胞生長受到抑制。細胞周期和細胞的生長密切相關(guān)，細胞周期過程為G0/G1→S→G2/M 期，G0/G1期為DNA 合成前期，標志細胞進入增殖態(tài)，增殖旺盛的細胞G0/G1期持續(xù)時間短，S期為DNA 合成、復制期，G2/M 期分別為DNA 合成后期及有絲分裂期。采用流式細胞術(shù)分析RNAi 對人乳腺癌細胞系MDA -MB -231 的生長抑制作用與細胞周期的關(guān)系，結(jié)果顯示pshRNA -COL1A1 組轉(zhuǎn)染72 h 后G0/G1期細胞比率明顯高于其它2 組。提示腫瘤細胞中COL1A1 基因被抑制后，影響細胞的細胞周期正常移行，阻止G0/G1期細胞進入S 期，造成pshRNA -COL1A1 組G0/G1期細胞聚集，S 期細胞減少，從而影響細胞的正常生長。同時，利用Hoechst 33258 染色和Annxeni V -FITC 檢測細胞的凋亡情況。結(jié)果顯示pshRNA - COL1A1 組細胞核固縮、核染色質(zhì)濃縮，細胞核呈濃染致密的顆粒塊狀熒光和核裂解塊狀熒光，細胞形態(tài)呈現(xiàn)出凋亡的典型變化。而且，與mock 組和scrambled 組相比，pshRNA-COL1A1 組細胞凋亡明顯增多，凋亡率達13.29%±0.43%，提示shRNA -COL1A1 轉(zhuǎn)染介導COL1A1表達沉默可以顯著促進乳腺癌MDA -MB -231 細胞發(fā)生早期凋亡。

綜上所述，利用RNAi 技術(shù)沉默COL1A1 基因表達后，能有效抑制MDA -MB -231 細胞的生長，并誘導其凋亡，為后續(xù)研究COL1A1 基因在乳腺癌MDA-MB-231 細胞中的功能提供一定的實驗依據(jù)，但COL1A1 基因?qū)θ橄侔┘毎纳L和凋亡作用的具體分子機制還有待進一步實驗探索。

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