姚海霞， 祝 卿， 吉 偉， 王淑君， 王良榮， 林麗娜△， 王萬鐵△

(溫州醫(yī)學(xué)院1附屬第一醫(yī)院麻醉科，2病理生理學(xué)教研室，浙江溫州325035)

在研究急性低氧對肺血管張力影響的實驗中，如何使肺血管環(huán)迅速獲得穩(wěn)定的低氧環(huán)境是研究前提。以往，低氧性肺血管收縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)研究多采用物理性低氧通氣法降低血管緩沖液Krebs-Henseleit(KH)液的氧分壓(oxygen partial pressure，PO2)，雖然此方法可對肺血管造成低氧相關(guān)性損傷，但卻必須配備裝有高精準(zhǔn)比例的氮氣和二氧化碳的儲氣瓶［1］，才能使血管KH液的PO2下降，而且在通入低氧氣體時要給浴槽加蓋保持密閉持續(xù)通氣很長時間，這種密閉環(huán)境在掛著血管環(huán)的狀態(tài)下非常不易操作，而且通入氣體的時間和KH液的PO2無法精準(zhǔn)監(jiān)測，不能保證每次實驗達到的低氧條件都是一致。因此快速制備出HPV離體血管實驗所需的穩(wěn)定的低氧性KH液具有重要意義。亞硫酸鈉(sodium sulfite，Na2SO3)作為一種主要的食品防腐劑，可快速去氧引發(fā)厭氧條件，從而有效地抑制好氧微生物的生長，且缺氧的程度和Na2SO3溶液的保質(zhì)期容易控制［2-4］。本研究擬在暴露空氣的開放環(huán)境中將無水Na2SO3加至0.5 L KH液中，利用Na2SO3結(jié)合水溶液中溶解氧的能力，以期獲得一種快速制備低氧性KH液的新方法，應(yīng)用于肺血管急性低氧實驗的離體研究。

材料和方法

1 材料

便攜式臨床分析儀 (型號:2-35451，i-STAT Corporation);pH計(型號:滬制01040055，梅特勒-托利多儀器上海有限公司);電熱恒溫水浴鍋(型號:HH.521-4-5，上海賀德實驗設(shè)備有限公司);溫度計;無水Na2SO3;KH液:0.5 L KH 液含 NaCl 3.2409 g，KCl 0.1752 g，MgSO40.1479 g ，NaHCO31.0501 g，KH2PO40.0816 g ，CaCl20.1387 g ，葡萄糖0.9000 g(上述試劑均為市售分析純級)。

2 方法

2.1 選用8份雙蒸水配置0.5 L KH液(溫度:37℃，pH 7.30～7.45)。在暴露空氣的開放環(huán)境下，分別加入0(A1，對照組)、0.2(A2)、0.5(A3)、0.8(A4)、1.1(A5)、1.4(A6)、1.5(A7)、1.6 g(A8)的無水 Na2SO3攪拌充分溶解后，1 mol/L HCl調(diào)定 pH 7.30 ～7.45，二氧化碳分壓(carbon dioxide partial pressure，PCO2)35～45 mmHg。分別在加樣后1 min取樣行成分分析，選擇符合低氧條件(PO2降低到40 mmHg以下)的Na2SO3-KH液進入以下研究。

2.2 根據(jù)加樣后1 min液體指標(biāo)測定，選擇1.5 g Na2SO3加至0.5 L KH液，充分溶解后，分別在加樣前和加樣后1、10、20、30、60、90 min 取樣行成分分析(pH、PCO2、PO2及 Na+濃度)。每次測定前先測定溶液pH，如pH超出范圍，先用HCl調(diào)節(jié)再測定各指標(biāo)。另外，由于Na2SO3進入水中反應(yīng)生成等 mol的Na2SO4，含2倍mol的Na+，明顯增加KH液Na+濃度，為了防止溶液出現(xiàn)高滲，經(jīng)過換算把增加的Na+通過減少NaCl的量使Na+滲透壓保持在135～155 mmol/L，本實驗把0.5 L KH液中加入的NaCl的劑量改為2.0563 g，其余成分的劑量不變。

2.3 根據(jù)上述方法，選擇1.5 g Na2SO3加至0.5 L KH液，充分溶解后，分別在加樣前和加樣后 0 h、1 h、2 h、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、、21 h、24 h 取樣進行成分分析(pH、PCO2和PO2)，觀察低氧溶液24 h的變化。

2.4 方法同 2.2，選擇 1.5 g Na2SO3加至 0.5 L KH 液，充分溶解后，分別在加樣前和加樣后第1 d、第2 d、第3 d、第4 d、第 5 d、第6 d、第7 d、第8 d、第 9 d、第10 d、第11 d 取樣進行成分分析(pH、PCO2和PO2)，觀察低氧溶液的維持狀態(tài)。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同劑量的Na2SO3對0.5 L KH液PO2的影響

各組0.5 L KH液中加不同劑量Na2SO31 min后，與對照組(A1)相比，溶液PO2降低(P＜0.01)，且隨著Na2SO3劑量的增加，PO2降低明顯(P＜0.01)，pH和PCO2改變無顯著差異(P＞0.05)。其中A7組PO2均處于20～40 mmHg范圍，最適合HPV離體模型實驗所需，見表1。

表1 溶入不同劑量Na2SO31 min后0.5 L KH液中pH、PCO2和PO2的變化Table 1.The values of pH，carbon dioxide partial pressure(PCO2)，oxygen partial pressure(PO2)after different doses of sodium sulfite(Na2SO3)dissolved in Krebs-Henseleit(KH)solution at 1 min(ˉx±s.n=8)

2 應(yīng)用1.5 g Na2SO3可使0.5 L KH溶液達到HPV所需的低氧性溶液并且可維持低氧狀態(tài)至少90 min

將1.5 g Na2SO3加入到0.5 L KH 液后PO2由(150.00 ±17.25)mmHg迅速降到(24.75 ±2.87)mmHg，加樣后20、30、60 min與1 min相比PO2改變未見顯著差異(P＞0.05)，而10 min與1 min相比PO2降低有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且90 min時 PO2為(27.50±1.41)mmHg，與 1 min時相比有所升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但二者PO2數(shù)值仍處于20～40 mmHg范圍內(nèi)。各時點的PCO2多處于正常范圍(35～45 mmHg);pH處于正常范圍(7.30～7.45);Na+滲透壓均處于正常范圍(135～155 mmol/L)，見表2。此低氧條件已滿足急性HPV離體實驗所需的低氧狀態(tài)的維持時間60 min。

3 應(yīng)用1.5 g Na2SO3達到的低氧狀態(tài)在24 h內(nèi)無變化

將1.5 g Na2SO3加入到0.5 L KH液后，加樣后各時點與1 min相比PO2和PCO2均無明顯變化(P＞0.05)，見圖1。

4 應(yīng)用1.5 g Na2SO3的低氧溶液PO2在加樣后第2 d開始上升，在第11 d上升至正常

將1.5g Na2SO3加入到0.5 L KH液后，第2 d之后的各時點與第1 d相比差異顯著(P＜0.05)，第11 d與未加樣前相比無顯著差異(P＞0.05)，見圖2。

表2 1.5 g Na2SO3溶入0.5 L KH液后各時點的 pH、PCO2、PO2和 Na+濃度的變化Table 2.The values of pH，PCO2，PO2，the concentration of Na+after 1.5 g Na2SO3dissolved in KH at various time points(ˉx±s.n=8)

Figure 1.Changes of PO2and PCO2after 1.5g Na2SO3dissolved in KH solution at various time points during the first day.ˉx±s.n=8.圖1 1.5 g Na2SO3溶入0.5 L KH 液后第 1 d(24 h)內(nèi)各時點PO2和PCO2的變化

Figure 2.Daily changes of PO2and PCO2after 1.5 g Na2SO3 dissolved in KH solution.ˉx±s.n=8.*P＜0.05 vs 1 d.圖2 1.5 g Na2SO3溶入0.5 L KH液后每天PO2和PCO2的變化

討 論

HPV是近年研究熱點，常見于當(dāng)肺泡氧分壓降到某一臨界值，肺血管發(fā)生快速、可逆的收縮反應(yīng)，以糾正肺泡通氣/灌流的不匹配，從而在不明顯改變肺動脈壓的情況下最大程度地提高機體氧分壓。短時間內(nèi)的HPV對機體是一種保護機制，但長期反復(fù)發(fā)作HPV卻是肺動脈高壓、肺源性心臟病的“元兇”，研究HPV機制對肺動脈高壓和肺心病以及慢性阻塞性肺疾病等防治機制的基礎(chǔ)研究有重要意義。在離體肺血管實驗中，如何快速有效地制備離體低氧模型所需的低氧性KH液是研究HPV的前提條件。目前多將離體肺血管置于低氧環(huán)境中，其基本實驗條件為:PO220～40 mmHg，PCO235～45 mmHg，pH 7.30 ～7.45。常用造模方法為物理性低氧法，即肺血管環(huán)平衡穩(wěn)定后向器官浴槽中通入的常氧氣體(95%O2和5%CO2)轉(zhuǎn)換為無氧氣體(95%N2和5%CO2)，并且要浴槽口加蓋密封使浴槽中KH液PO2達到(40±10)mmHg。此方法不足之處首先是實驗中轉(zhuǎn)換氣體條件時常出現(xiàn)時間和氣壓不同步，并且浴槽中KH液的PO2、PCO2和pH在各個時點無法實時監(jiān)測，不能控制PO2降低的程度，PO2達到要求的時點和氣體的流速不好把握，即使PO2達到要求，并不能完全保證PCO2在正常范圍內(nèi)。其次，當(dāng)達到所需要的低氧條件后，如果要進行后期的藥物干預(yù)須經(jīng)浴槽口直接加藥物的話就不可避免地破壞密閉環(huán)境，大氣壓氧的影響使降低的PO2極易變化而不穩(wěn)定，影響實驗質(zhì)量。

Abudara等［5］和胡清華等［6］使用硫代硫酸鈉剝奪水溶液中的氧模擬低氧反應(yīng)，類似于物理性低氧。然而，硫代硫酸鈉容易自燃，它與水反應(yīng)是放熱反應(yīng)，反應(yīng)后生成Na2SO3和二氧化硫(SO2)。也有研究用氯化鈷與鐵(氧傳感途徑的重要因子)競爭的機制制作化學(xué)性缺氧模型，但是氯化鈷是一種重金屬具有組織和細胞毒性［7］。研究報道［8］Na2SO3可以降低水溶液中的溶解氧濃度，并且能激活缺氧誘導(dǎo)因子-1調(diào)控途徑，表明Na2SO3是一種潛在的可模擬低氧應(yīng)激的刺激物［2］。并且 Na2SO3和水的反應(yīng)不自燃，也不產(chǎn)生 SO2，Na2SO3進入水溶液中與氧反應(yīng)生成的硫酸鈉(Na2SO4)對機體的危害與低氧相比幾乎是沒有毒性的。因此Na2SO3相比硫代硫酸鈉更有優(yōu)勢［2］。

本研究結(jié)果表明，在開放環(huán)境中，不同劑量Na2SO3可使0.5 L KH液PO2降低，并呈劑量依賴性，即溶液中Na2SO3的量越大，PO2就越低。從表1中可見尤其是加1.5 g Na2SO3可使PO2降低到40 mmHg以下，這個條件符合于離體肺血管低氧實驗的研究條件。且1.5 g Na2SO3-KH低氧溶液暴露在空氣中90 min，發(fā)現(xiàn)PO2基本穩(wěn)定，而溶液pH值、PCO2和Na+滲透壓無明顯變化。這與完全去除溶解在1 L水中的溶解氧需要0.08 g Na2SO3［8］的理論相吻合，因為大氣氧會逐漸地再溶解于水溶液中，低濃度的Na2SO3不可能完全去除水溶液中的溶解氧，按照前述的理論換算，0.5 L KH中加入的1.5 g Na2SO3中，其中0.04 g是用于去除水中的溶解氧，剩余的1.46 g是用于抑制大氣壓氧的再溶解從而保證其低氧狀態(tài)(20～40 mmHg)維持一定時間段。就這一點說，Na2SO3達到的低氧狀態(tài)在可控性和穩(wěn)定性上具有優(yōu)勢;而且離體血管處于開放的環(huán)境，無需將浴槽加蓋，便于用一些特殊的儀器和試劑對血管進行干預(yù)并作及時的觀察。因此，1.5 g Na2SO3加入0.5L KH液中充分溶解后，可滿足急性低氧性肺血管實驗所需的低氧條件，并且維持此低氧狀態(tài)最少90 min，足以達到肺血管實驗的急性低氧時間1 h。

此外，本研究結(jié)果3和4發(fā)現(xiàn)，1.5 g Na2SO3-KH低氧溶液的低氧狀態(tài)在24 h內(nèi)無變化，在第2 d PO2開始上升，在第11 d上升至正常值，低氧狀態(tài)最多可以維持24 h，足以達到HPV離體實驗?zāi)Ｐ偷募毙缘脱鯐r間1 h.

Jiang等［4］最新研究得出結(jié)論:Na2SO3能降低M9緩沖液中的溶解氧，是一種模擬低氧應(yīng)激的潛在因子，其誘發(fā)的低氧環(huán)境建造的線蟲低氧模型和物理性低氧模型一致，證明Na2SO3可以用于建造低氧實驗?zāi)Ｐ偷难芯?，但并未具體驗證Na2SO3是否可以用于血管、細胞或其它靶組織低氧實驗的研究。因為血管、細胞等離體器官的實驗其各自的緩沖液各不相同，如離體血管的緩沖液是 KH，離體細胞的培養(yǎng)液是DMEM液，線蟲的緩沖液則為M9緩沖液。各自緩沖液的成分比例差別很大。Jiang等［4］研究的Na2SO3降低M9緩沖液的氧程度和維持能力不一定與KH液和DMEM液相同，也許會因為成分的不同互相影響而發(fā)生變化。因此Na2SO3是否可以用于制備血管或細胞的缺氧模型仍需實驗驗證。因此，本研究是在Jiang等［4］的研究基礎(chǔ)上具體探索了Na2SO3是否可以用于制備低氧性肺血管收縮實驗所需的低氧性KH液的可行性，并進一步支持了Jiang等［4］的研究結(jié)果。本研究結(jié)果為開展Na2SO3在其它血管如主動脈血管或腸系膜血管或細胞等靶器官低氧研究中的應(yīng)用提供了可能的依據(jù)，從而為解決低氧研究提供新方法和解決途徑。本研究測定的指標(biāo)除PO2外，還觀察了低氧溶液的pH值、PCO2和Na+滲透壓，保證了肺血管處于一個穩(wěn)定的低氧性環(huán)境。此外，本方法造價低廉，制作簡單，使用方便，為低氧實驗的研究提供了一種新手段。

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