白永恒， 陸 紅， 周 琴， 林成成， 梁 勇， 洪煒龍， 鄭少玲， 陳必成△

(溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院1外科實驗室，2實驗診斷中心，3移植中心，浙江 溫州325000)

腎小管間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)幾乎是所有慢性腎臟疾病發(fā)展到后期的病理學特征，TIF 程度是反映腎功能下降嚴重程度和判斷預后最重要的指標。因此，研究TIF 的分子機制，探索有效的防治措施，對延緩終末期腎病的進程，延長患者壽命意義重大。最近研究顯示，Sonic hedgehog(Shh)信號在膽管、肝臟纖維化過程中均存在異?；罨F(xiàn)象，阻斷Shh 信號的傳遞可抑制纖維化的形成［1-2］。然而，Shh 通路是否參與TIF 進程目前尚不清楚。因此，本研究通過建立單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎纖維化模型(unilateral ureteral obstruction，UUO)，以探討Shh 信號通路在TIF 形成中的作用及其分子機制。

材 料 和 方 法

1 材料

48 只雄性SD 大鼠(體重180 ～200 g)購于溫州醫(yī)學院動物實驗中心，飼養(yǎng)于SPF 級環(huán)境，給予標準的飲食和飲水，于實驗前1 d 開始禁食。

2 方法

2.1 動物模型及分組 將大鼠隨機分為假手術(shù)組(n=24)和單側(cè)輸尿管結(jié)扎組(UUO，n =24)。假手術(shù)組開腹后游離左側(cè)輸尿管隨即縫合皮膚，UUO 組進行左側(cè)輸尿管結(jié)扎。模型標準化關(guān)鍵在于無菌操作和結(jié)扎位置靠近腎盂并與腎盂的距離固定。2 組大鼠分別于術(shù)后第3、7 和14 d 在10%水合氯醛的麻醉下行腹腔靜脈放血，然后取腎臟標本。

2.2 病理檢查 梗阻側(cè)腎臟取出后，進行縱軸和橫軸測量。橫截面切割切開后加入10%多聚甲醛固定，按常規(guī)方法進行組織脫水、透明、浸蠟和包埋。切成約4 μm 厚的切片，經(jīng)脫蠟、梯度乙醇和蘇木精-伊紅染色(碧云天生物公司)，中性樹膠封片。通過顯微鏡觀察腎臟切片，按腎小管損傷程度給出評價。同時通過圖像分析系統(tǒng)，量取擴增腎小管最長徑代表腎小管擴張程度，分析各組腎小管的擴增程度。

2.3 Masson 染色 石蠟切片脫蠟后，按Masson 試劑盒說明書操作(上海源葉生物公司)。Harris's 蘇木素液染核10 min;麗春紅酸性染液染色10 min，0.2%醋酸速洗2 次;1%磷鉬酸作用5 min，直接用1%亮綠SF 染色3 min;直接95%乙醇分化30 s;脫水、透明、封片、鏡檢。

2.4 腎臟總RNA 提取 將大鼠新鮮腎臟組織置于液氮中保存。采用Trizol 試劑(Invitrogen)提取大鼠腎臟RNA，并于260/280 nm 測定吸光度值，分析樣本純度。根據(jù)試劑說明書(Toyobo)將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存，備用。

2.5 Real -time RT -PCR 檢測Shh 信號和纖維化相關(guān)分子的表達 應用Primer 5.0 軟件設計針對Shh 信號通路分子Shh、Smo、Ptch1 和Gli1，纖維化指標TGF-β1、I 和III 型膠原(Col I、Col III)mRNA 特異性引物，以β-actin 作為內(nèi)參照，采用相對定量法計算獲得結(jié)果。引物序列見表1 所示，由上海生工公 司 合 成。相 對 表 達 量 = 2-ΔΔCt，ΔΔCt =［Ct目的基因(待測樣品)-Ct內(nèi)參照(待測樣品)］-［Ct目的基因(校正樣品)-Ct內(nèi)參照(校正樣品)］。PCR 程序為:95 ℃3 min 預變性，1 個循環(huán);95 ℃5 s，60/62 ℃35 s，40 個循環(huán)。同時采用熔解曲線分析來評價PCR 結(jié)果可靠性。

表1 Shh 信號和纖維化相關(guān)基因的mRNA 特異性引物Table 1. Specific mRNA primers for Shh signaling and fibrosis-related genes

2.6 免疫組織化學染色檢測Shh 信號分子和Ⅲ型膠原的表達 用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化酶(SP)法(中杉金橋生物公司)。所有標本用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后連續(xù)切片，厚4 μm。羊抗鼠Shh、Ptch1 和Smo 多克隆抗體、Gli1 單克隆抗體購自Santa Cruz，III 型膠原多克隆抗體購自Bioword。Ⅰ抗稀釋度:Ptch1 為1∶200，其余均為1∶100，檸檬酸鹽微波輻射進行抗原修復，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后經(jīng)蘇木精復染。以Ⅰ抗稀釋液代替Ⅰ抗作為陰性對照，用小鼠胃組織切片作為陽性對照［3］。細胞內(nèi)或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達。應用Image -Pro Plus 6.0 軟件分析各組別免疫組化切片的平均吸光度值。

2.7 ELISA 檢測腎組織中TGF -β1和Shh 含量

取200 mg 組織，用2 mL PBS 進行勻漿溶解，TGF -β1和Shh 含量的檢測采用雙抗體夾心ABC -ELISA法(上海西唐生物)，450 nm 處測A 值，通過繪制標準曲線求出濃度。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0 軟件包進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間均數(shù)比較采用t 檢驗或單因素方差分析，評價Shh 蛋白與TGF -β1含量的關(guān)系采用直線相關(guān)分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 UUO 大鼠的腎間質(zhì)纖維化程度

如圖1 所示，大鼠腎組織石蠟切片經(jīng)HE 染色，鏡下觀察腎組織常規(guī)病理，結(jié)果顯示對照組腎臟結(jié)構(gòu)正常，腎小管排列緊密、整齊，小管基底膜光滑、連續(xù)，小管間質(zhì)區(qū)無炎癥細胞浸潤。UUO 組術(shù)后7 d，腎間質(zhì)炎癥細胞局灶或彌漫性浸潤，腎小管輕度擴張，小管間質(zhì)區(qū)面積增大。Masson 染色顯示，UUO大鼠腎間質(zhì)膠原相對面積增大，膠原纖維增多。此外，免疫組織化學及real -time RT -PCR 檢測的結(jié)果也顯示，TGF-β1含量、I 型和III 型膠原mRNA 和蛋白表達水平也明顯上調(diào)(P ＜0.05)，見圖2、3。

Figure 1. Evaluation of renal fibrosis in UUO rats (HE and Masson staining，×50).圖1 HE 和Masson 染色法檢測UUO 大鼠腎間質(zhì)纖維化程度

Figure 2. The mRNA expression of TGF -β1，type I and III collagen were detected by real -time RT -PCR. ±s. n =6. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham group.圖2 Real-time RT-PCR 檢測I 型和III 型膠原mRNA 的表達情況

Figure 3. Expression of type III collagen detected by immunohistochemical analysis (×200).圖3 免疫組織化學檢測III 型膠原蛋白的表達

2 Shh 通路在UUO 大鼠中的表達情況

免疫組織化學染色和real -time RT -PCR 的結(jié)果顯示，UUO 大鼠中Shh 信號通路抑制分子Ptch1表達明顯下調(diào)(P ＜0.01)，而信號活化相關(guān)蛋白Shh、Smo 和Gli1 表達升高(P ＜0.05)，提示梗阻腎纖維化發(fā)生過程中Shh 信號被激活，見圖4、5。

Figure 4. Expression of Shh signaling proteins in UUO rats (immunohistochemical staining，×100). ±s.n=6. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham group.圖4 Shh 信號分子在UUO 大鼠腎間質(zhì)纖維化中的表達

3 UUO 大鼠Shh 信號起始信號蛋白與TGF -β1的關(guān)系

ELISA 結(jié)果顯示，UUO 大鼠在泌尿管梗阻后的不同時點(3、7 和14 d)，Shh 信號起始信號蛋白Shh分泌水平和促纖維因子TGF-β1含量之間呈現(xiàn)明顯正相關(guān)(r =0.982，P ＜0.05)，提示活化的Shh 信號通路誘導TGF-β1表達和釋放，導致腎間質(zhì)纖維化。

討 論

Figure 5. The mRNA expression of Shh signaling-related genes detected by real-time RT-PCR. ±s.n=6. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham group.圖5 Real-time RT-PCR 檢測Shh 信號相關(guān)基因mRNA的表達

Shh 通路是一條進化保守的信號通路，在從低等動物(果蠅)到高等動物(人類)中普遍存在。Shh 通路主要由Hedgehog 配體(Shh)、2 個膜受體Ptch、Smo 及下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli 組成［4］。感受器蛋白Ptch 和信號開關(guān)蛋白Smo 是位于細胞膜上的跨膜蛋白，其中Ptch 為Shh 蛋白的受體。當不存在Shh 蛋白時，Ptch 抑制Smo 的活性，進而抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄表達。當存在Shh 蛋白并與Ptch 結(jié)合時，Smo 的抑制效應被解除，便可激活下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Gli，進而誘導目標基因的表達。這些目標基因中包含與細胞增殖相關(guān)的基因，如c-myc、cyclin C 和cyclin D 等。正常表達的Shh 信號在人類發(fā)育過程中起著重要作用，如參與神經(jīng)管分化、血管生成及牙齒發(fā)育等［5］。但持續(xù)異常激活的Shh 信號可導致不同類型增殖性疾病的發(fā)生，包括誘發(fā)胰腺癌、胃癌等腫瘤的發(fā)生［6］。此外，最近的研究也顯示，活化的Shh信號也與組織纖維化的發(fā)生密切相關(guān)［1-2］。

然而，尚不清楚活化的Shh 信號通過何種機制影響纖維化進程。有研究顯示，活化的Shh 信號通路可誘導TGF -β1高表達［7］。高TGF -β1表達不僅促進促進上皮細胞轉(zhuǎn)分化為成纖維細胞(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，參與局部的炎癥反應［8-9］，同時，也大量分泌表達細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，包括I 型膠原和III 型膠原。遭受EMT 后形成的成纖維細胞也可分泌表達多種炎癥因子和ECM 成分，這些ECM 成分在細胞間質(zhì)持續(xù)不斷的累積是導致纖維化發(fā)生的直接原因。因此，通過分析Shh 信號與TGF-β1的關(guān)系，可以在深入認識信號轉(zhuǎn)導在纖維化發(fā)生過程中的作用。

本研究通過建立單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎纖維化模型，發(fā)現(xiàn)了梗阻側(cè)腎組織出現(xiàn)明顯的纖維化病變，且隨梗阻時間延長而加劇。與此同時，TGF -β1含量也明顯升高。TGF-β1含量的增加推測可能與泌尿管梗阻后局部低氧、細胞表面壓力增大導致局部腎小管上皮細胞損傷有關(guān)［10］。在這種微環(huán)境中，我們發(fā)現(xiàn)Shh 信號通路被激活。這種活化可能是反饋性，也可能是主動的，并且信號的活化是通過旁分泌或自分泌途徑產(chǎn)生Shh 蛋白得以實現(xiàn)的。我們的實驗結(jié)果顯示，Shh 信號起始信號蛋白Shh 含量與TGF-β1明顯相關(guān)，在梗阻早期呈現(xiàn)低表達，而隨著梗阻時間延長，表達量明顯呈現(xiàn)同步性提高，提示活化的Shh 信號通路誘導TGF -β1表達和釋放，導致腎間質(zhì)纖維化。這一結(jié)果與其它文獻報道的Shh 信號參與肝臟、膽管纖維化相似。膽汁性肝硬化病人或者人為誘導膽管纖維化動物模型中，均發(fā)現(xiàn)Shh 信號存在不同程度的活化［1］。同樣，在肝臟纖維化過程中，Shh 信號也被過度活化［2］。敲除Ptch 基因，使Shh 信號過度活化，可促進TGF -β1表達，進而促進膽管上皮細胞EMT 及膽管纖維化的發(fā)生［1］。體外實驗中，通過外源性激活Shh 信號，也可加快肝細胞EMT，促進肝臟纖維化。采用環(huán)杷明(cyclopamine)特異性抑制Shh 信號，可抑制TGF-β1表達，能有效減輕甚至逆轉(zhuǎn)纖維化［2，11］。

因此，來自體內(nèi)實驗的結(jié)果顯示，活化的Shh 信號通路誘導TGF -β1表達和釋放，導致腎間質(zhì)纖維化。然而，Shh 信號各分子在腎纖維化中的具體功能和定位，及信號干預措施尚還需體外實驗來研究和證實。因此，下一階段，調(diào)控Shh 信號通路的研究，尤其是核轉(zhuǎn)錄基因Gli1 靶向性基因治療的開展，可能為治療腎間質(zhì)纖維化開辟一條嶄新的途徑。

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