郭曉鶴， 張彩鳳△， 夏永華， 李貞娟， 周慧聰， 韓 宇

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1消化科，2皮膚科，河南 新鄉(xiāng)453100)

細(xì)胞黏附分子1(cell adhesion molecule 1，CADM1)，稱為肺癌腫瘤抑制物1(tumor suppressor in lung cancer 1，TSLC1)，已經(jīng)在非小細(xì)胞肺癌中被鑒定，其基因定位于人類染色體11q23.2［1－2］。CADM1 基因編碼 442 個(gè)氨基酸，屬于免疫球蛋白超家族，結(jié)構(gòu)上與神經(jīng)細(xì)胞黏附分子具有高度的同源性，主要牽涉到鈣離子非依賴的細(xì)胞－細(xì)胞間的黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［3－4］。最近，大量研究顯示，CADM1在一系列人類腫瘤組織和細(xì)胞系中呈低表達(dá)或缺失，包括食管癌［5］、宮頸癌［6］、肝癌［7］、卵巢癌［8］、乳腺癌等［9］，然而在胃癌中尚未見相關(guān)的研究報(bào)道。因此在本研究中，我們分析不同胃癌細(xì)胞系中CADM1蛋白的表達(dá)，并構(gòu)建pcDNA－CADM1真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞并篩選和鑒定穩(wěn)定細(xì)胞株，接著研究CADM1過表達(dá)對細(xì)胞增殖和細(xì)胞侵襲的影響，并初步研究其可能的分子機(jī)制，該研究旨在為以CADM1為靶點(diǎn)的胃癌基因治療提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

人胃癌細(xì)胞MKN－28(高分化)、SGC－7901(中分化)和MKN－45(低分化)均購自中科院上海細(xì)胞所。真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)載體、脂質(zhì)體2000和Trizol試劑均購自Invitrogen;PCR Mix購自北京天根生化科技有限公司;T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I以及細(xì)胞裂解液均購自寶生物工程(大連)有限公司;cDNA第1鏈合成試劑盒購自上海生工生物工程有限公司;RPMI－1640、DMEM培養(yǎng)液和胰蛋白酶均購自Gibco;胎牛血清購自杭州四季青公司;CCK－8試劑購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司;抗體CADM1、p21、基質(zhì)金屬蛋白酶 2(matrix metalloproteinase 2，MMP－2)、MMP－9和β－actin均購自 Santa Cruz。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 胃癌細(xì)胞株MKN－28和SGC－7901均培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液中，MKN－45培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞均置于37℃、5%CO2的孵箱中生長。

2.2 pcDNA－CADM1真核表達(dá)載體的構(gòu)建 從SGC－7901細(xì)胞中采用Trizol提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA為模板，CADM1上游引物 5’－CCGGAATTCATGGCGAGTGTAGTGCTGCC－3’(EcoR I)下游引物 5’－CCGCTCGAGCTAGATGAAGTACTCTTTC－3'(Xho I)，產(chǎn)物大小1 329 bp。PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性10 min，然后94℃ 40 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸6 min。接著將CADM1片段和載體均分別采用EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切，然后在T4 DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，接著轉(zhuǎn)化、挑克隆、提質(zhì)粒，酶切鑒定。

2.3 pcDNA3.1和 pcDNA－CADM1轉(zhuǎn)染 當(dāng) MKN－45細(xì)胞達(dá)到90%左右融合時(shí)，利用脂質(zhì)體2000將pcDNA3.1和pcDNA－CADM1轉(zhuǎn)染MKN－45細(xì)胞，細(xì)胞分為3組:未處理組(未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的MKN－45細(xì)胞)、pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的MKN－45細(xì)胞)和pcDNA－CADM1組(轉(zhuǎn)染pcDNA－CADM1的MKN－45細(xì)胞)，轉(zhuǎn)染后采用600 mg/L G418進(jìn)行篩選，當(dāng)出現(xiàn)明顯的克隆后，對照細(xì)胞全部死亡時(shí)進(jìn)行傳代直至獲得穩(wěn)定細(xì)胞株，最后采用400 mg/L的G418維持培養(yǎng)。

2.4 細(xì)胞增殖分析 3組MKN－45細(xì)胞分別在96孔板上接種 1 000 cells/well，測定其培養(yǎng) 0、24、48、72、96 及 120 h 時(shí)的增殖情況，每個(gè)樣品接種5個(gè)復(fù)孔，在測定細(xì)胞增殖時(shí)，加入10%CCK－8試劑，于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，然后于酶標(biāo)儀上測定450 nm的吸光度。

2.5 Boyden chamber體外侵襲能力的檢測 將3組MKN－45細(xì)胞分別培養(yǎng)至大約105個(gè)細(xì)胞時(shí)，分別懸浮在含有0.2%胎牛血清的800 μL培養(yǎng)液中，然后依次接種至Boyden chamber的上層，培養(yǎng)6 h。收集遷移到濾膜下層的細(xì)胞，用甲醇固定，并通過HE染色觀察下層細(xì)胞的數(shù)量，最后通過計(jì)算濾膜下層的細(xì)胞數(shù)來評估其轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)量(30個(gè)視野，×200)。

2.6 Western blotting 收集 MKN －28、SGC－7901和 MKN－45細(xì)胞以及不同處理的MKN－45細(xì)胞，采用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，接著進(jìn)行SDS－PAGE電泳，然后將凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST液封閉 NC 膜 2 h，加入Ⅰ抗(CADM1、p21、MMP－2、MMP－9和β－actin，均1∶200)，4℃ 搖床孵育過夜。加入Ⅱ抗室溫孵育2 h。將NC膜置于ECL(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑)中反應(yīng)1～3 min，于暗室中利用X射線曝光，常規(guī)方法顯影定影，顯示特異的蛋白信號(hào)。蛋白表達(dá)的灰度值利用Image－Pro Plus 5.0軟件進(jìn)行分析，蛋白相對表達(dá)為目的基因與內(nèi)參基因的比值，β－actin作為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，3組之間比較采用單因素方差分析(One－way ANOVA)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 3種胃癌細(xì)胞株中CADM1蛋白的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，低分化的MKN－45細(xì)胞中CADM1蛋白的表達(dá)水平明顯低于中分化的SGC－7901細(xì)胞和高分化的MKN－28細(xì)胞(P＜0.05)，而中分化的SGC－7901細(xì)胞中CADM1蛋白的表達(dá)水平與高分化的MKN－28細(xì)胞之間無顯著差異(P＞0.05)，見圖1，因此在下面的實(shí)驗(yàn)中采用CADM1蛋白表達(dá)水平最低的MKN－45進(jìn)行研究。

Figure 1.Expression of CADM1 protein in three gastric carcinoma cell lines.ˉx±s.n=3.*P＜0.05 vs MKN－28 or SGC －7901 cells.圖1 3種胃癌細(xì)胞株中CADM1蛋白的表達(dá)

2 真核表達(dá)載體的構(gòu)建及穩(wěn)定表達(dá)CADM1細(xì)胞株的鑒定

采用PCR擴(kuò)增CADM1基因，結(jié)果表明，CADM1全長cDNA片段被成功獲得，見圖2A。我們進(jìn)一步將片段和pcDNA3.1空載體均采用EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化，挑克隆、提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定，酶切結(jié)果表明獲得了預(yù)期的載體帶和目的條帶，表明真核表達(dá)載體pcDNACADM1成功構(gòu)建，見圖2B。將所構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA－CADM1和空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染MKN－45細(xì)胞，獲取穩(wěn)定細(xì)胞株后，采用 Western blotting進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明pcDNA－CADM1組中CADM1蛋白表達(dá)顯著高于pcDNA3.1組和未處理組(P＜0.05)，而未處理組和pcDNA3.1組之間CADM1蛋白表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)，見圖3。

Figure 2.Construction of eukaryotic expression vector pcDNACADM1.A:PCR amplication of CADM1 gene.1:PCR product;M:GeneRuler DNA Ladder Mix.B:identification of eukaryotic expression vector pcDNACADM1.1:pcDNA －CADM1 digested with double enzymes EcoR I and Xho I;M:GeneRuler DNA Ladder Mix.圖2 pcDNA－CADM1真核表達(dá)載體的構(gòu)建

Figure 3.Identification of MKN－45 cells stably overexpressing CADM1.圖3 過表達(dá)CADM1的MKN－45穩(wěn)定細(xì)胞株的鑒定

3 CADM1過表達(dá)抑制MKN－45細(xì)胞的增殖

與未處理組和pcDNA3.1組相比，pcDNA－CADM1組在培養(yǎng)后的各時(shí)點(diǎn)，MKN－45細(xì)胞的增殖均明顯受到抑制，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);未處理組和pcDNA3.1組在培養(yǎng)的各時(shí)點(diǎn)，MKN－45細(xì)胞的增殖無顯著差異(P＞0.05)，見圖4。

Figure 4.Effect of overexpression of CADM1 on proliferation of MKN－45 cells.ˉx±s.n=3.*P＜0.05 vs non－treatment or pcDNA3.1.圖4 CADM1過表達(dá)對MKN－45細(xì)胞增殖的影響

4 CADM1過表達(dá)對MKN－45細(xì)胞侵襲的影響

與未處理組(101.53 ±6.89)和 pcDNA3.1 組(98.77 ±7.03)相比，pcDNA－CADM1組中MKN－45細(xì)胞穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)(52.35±3.89)顯著減少(P＜0.05)，未處理組和pcDNA3.1組中MKN－45細(xì)胞穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)無顯著差異(P＞0.05)。

5 CADM1過表達(dá)對MKN－45細(xì)胞中增殖和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與未處理組和pcDNA3.1組相比，pcDNA－CADM1組中p21蛋白表達(dá)顯著升高，而MMP－2和MMP－9蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而未處理組和pcDNA3.1組中上述各蛋白表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)，見圖5。

討 論

越來越多的研究表明，CADM1在多種不同腫瘤中均作為腫瘤抑制物而發(fā)揮作用［6，9－13］。目前在許多腫瘤中發(fā)現(xiàn)CADM1表達(dá)的缺失或降低，并證實(shí)其牽涉到許多腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移［2，14－16］。Takahashi等［17］研究表明，67 例原發(fā)性乳腺癌中具有異常的CADM1表達(dá)。Chen等［18］發(fā)現(xiàn)8個(gè)結(jié)腸癌中有7個(gè)出現(xiàn)CADM1的低表達(dá)，而54例原發(fā)性結(jié)腸癌中有39例出現(xiàn)CADM1的低表達(dá)。本研究中，我們選擇3種分化程度不同的胃癌細(xì)胞株，利用Western blotting檢測3種細(xì)胞中CADM1蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，3種胃癌細(xì)胞中均明顯出現(xiàn)CADM1蛋白表達(dá)，隨著分化程度降低，CADM1蛋白表達(dá)水平也顯著下調(diào)，即低分化的MKN－45細(xì)胞中CADM1蛋白的相對表達(dá)水平顯著低于中分化的SGC－7901細(xì)胞和高分化的MKN－28細(xì)胞，提示CADM1的表達(dá)與胃癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

Figure 5.Expression of p21，MMP－2 and MMP－9 proteins in MKN－45 cells with different treatments.ˉx±s.n=3.*P ＜0.05 vs non －treatment or pcDNA3.1.圖5 p21、MMP－2和MMP－9在不同處理的MKN－45細(xì)胞中的表達(dá)

為了進(jìn)一步研究CADM1在胃癌細(xì)胞中的功能，我們構(gòu)建CADM1的真核表達(dá)載體 pcDNA－CADM1，將其轉(zhuǎn)染到CADM1表達(dá)水平最低的MKN－45細(xì)胞株中，篩選穩(wěn)定表達(dá)CADM1的胃癌細(xì)胞株，進(jìn)一步采用Western blotting鑒定，結(jié)果顯示，篩選到的穩(wěn)定表達(dá)CADM1的MKN－45細(xì)胞中其CADM1蛋白表達(dá)水平顯著高于未處理組和pcDNA3.1組(P＜0.05)，提示pcDNA－CADM1真核表達(dá)載體的引入能明顯上調(diào)MKN－45細(xì)胞中CADM1蛋白表達(dá)水平，這也為后續(xù)進(jìn)一步研究CADM1的功能提供理想的研究平臺(tái)。

研究顯示，CADM1是細(xì)胞增殖和細(xì)胞侵襲的關(guān)鍵調(diào)控因子［19－20］。Mao等［21］研究發(fā)現(xiàn) CADM1 過表達(dá)可抑制A549 細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制A549皮下接種的腫瘤至70% ～80%的程度。此外，Lung等［11］的研究表明CADM1在有轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的鼻咽癌中表達(dá)下調(diào)或缺失的頻率為83%，顯著高于原發(fā)性鼻咽癌的12%(P＜0.05)，提示CADM1與侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。是否上調(diào)胃癌MKN－45細(xì)胞中CADM1蛋白的表達(dá)能改變胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力?因此，在本研究中，我們采用CCK－8研究3組MKN－45細(xì)胞中細(xì)胞增殖的變化，結(jié)果顯示與未處理組和pcDNA3.1組相比，pcDNACADM1組在培養(yǎng)后的各時(shí)點(diǎn)，MKN－45細(xì)胞的增殖均明顯受到抑制(P＜0.05)。此外，我們還利用Boyden小室體外遷移實(shí)驗(yàn)檢測3組胃癌細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pcDNACADM1組中MKN－45細(xì)胞遷移到matrigel的細(xì)胞數(shù)明顯低于未處理組和pcDNA3.1組(P＜0.05)，上述研究結(jié)果提示CADM1的過表達(dá)能明顯抑制胃癌MKN－45細(xì)胞的增殖和降低其遷移能力，但其分子機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

研究表明，p21與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，其在腫瘤細(xì)胞中能明顯傳遞抗增殖信號(hào)［22］。而2種主要的金屬基質(zhì)蛋白酶MMP－2和MMP－9與許多腫瘤的惡性程度有關(guān)，主要由于其獨(dú)特的降解IV型膠原能力，這也是基底膜的主要構(gòu)成成份［23］，提示其表達(dá)水平的高低與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。因此，為了初步了解CADM1介導(dǎo)胃癌細(xì)胞增殖抑制和侵襲能力降低的可能分子機(jī)制，我們采用Western blotting分析了3組MKN－45胃癌細(xì)胞中p21、MMP－2和MMP－9蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)pcDNA－CADM1組中p21蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，而MMP－2和MMP－9蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P＜0.05)，表明CADM1介導(dǎo)胃癌細(xì)胞增殖抑制和侵襲能力降低可能與p21蛋白表達(dá)水平的升高以及MMP－2和MMP－9蛋白表達(dá)水平的降低密切相關(guān)。

總之，本研究結(jié)果顯示，CADM1的過表達(dá)能明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，其變化可能與p21、MMP－2和MMP－9蛋白表達(dá)的變化密切相關(guān)。進(jìn)一步研究CADM1在胃癌中的功能有望為以CADM1為靶點(diǎn)的胃癌基因治療提供理論依據(jù)。

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