胡伊樂，郭紹芳，涂心明

在治療一些因基因缺陷造成的先天性疾病時，傳統(tǒng)的化學(xué)藥物治療不能取得良好的效果，尋求一種新的治療方法成為研究的熱點。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，生命科學(xué)許多領(lǐng)域的研究都發(fā)生了質(zhì)的飛躍[1]?；蚩寺　y序、基因表達等分子生物學(xué)研究方法的日臻成熟, 為轉(zhuǎn)基因技術(shù)的產(chǎn)生奠定了基礎(chǔ)，也為這些疾病的治療提供了一種新的方法。在基因治療中以真核載體為代表的非病毒載體以其制備方便、低毒、低免疫反應(yīng)等優(yōu)勢越來越多地被應(yīng)用于臨床與科研中[2]。真核載體由于不整合入機體細胞基因組，隨著細胞的分裂與增殖其表達能力逐漸衰減，需要不斷有新的外源性基因補充。本試驗通過對PCDNA3.1(+)-EGFP、pEGFP-C3、pIRES-GFP 3種綠色熒光真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后在細胞內(nèi)的表達時間，并將前腦啡肽原基因連接到pEGFP-C3、pIRES-GFP上使其在細胞內(nèi)表達，根據(jù)細胞上清液放免結(jié)果推斷出真核載體的表達時效，為基因治療的給藥間隔提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；PCDNA3.1(+)-EGFP、pEGFP-C3、pIRES-GFP綠色熒光載體由河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)實驗室保存；NIH3T3細胞來自河南省農(nóng)科院；6孔細胞培養(yǎng)板、凍存管購自上海寶生物有限公司；RT-PCR試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、G418購自鄭州天根生物有限公司；亮氨酸腦啡肽(L-ENK)放免試劑盒購置于第二軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究所。

1.2綠色熒光載體-PENK載體的構(gòu)建取大鼠腦組織液氮冷凍后研碎，提取腦組織總RNA。設(shè)計并制備兩端加上相應(yīng)酶切位點的引物，逆轉(zhuǎn)錄獲單鏈cDNA，PCR擴增大鼠前腦啡肽原基因PENK。將獲取的大鼠前腦啡肽原基因雙酶切，連接到pEGFP-C3、pIRES-GFP綠色熒光載體上獲得pEGFP-C3-PENK、pIRES-GFP-PENK重組載體。

1.3體外細胞轉(zhuǎn)染實驗與檢測解凍NIH3T3細胞并傳代3次以保證細胞活性的恢復(fù)，轉(zhuǎn)入6孔培養(yǎng)板待細胞鋪滿培養(yǎng)皿底部達75%時，按脂質(zhì)體2000說明書操作步驟將PCDNA3.1(+)-EGFP重組質(zhì)粒pEGFP-C3-PENK、pIRES-GFP-PENK與NIH3T3細胞按比例混合繼續(xù)細胞培養(yǎng)。

1.4陽性細胞的觀察與統(tǒng)計細胞轉(zhuǎn)染后24 h換含有胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并觀察其轉(zhuǎn)染效果、48 h時進行換液并觀察細胞綠色熒光的表達，此后每隔48 h在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，每孔在40倍視野下隨即選取6個視野，記錄每個視野中顯示綠色熒光的陽性細胞的數(shù)量，將6視野細胞數(shù)求和并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5細胞上清液放免測定由于腦啡肽容易被降解，為保證放免結(jié)果的準確性，每次觀察細胞時取0.5 mL細胞上清液，迅速置95℃水浴鍋中使其固定保存。利用亮氨酸腦啡肽放免試劑盒測定細胞上清液中腦啡肽的濃度。

2 結(jié)果

2.1細胞綠色熒光的表達轉(zhuǎn)染3種真核質(zhì)粒的細胞綠色熒光的表達見圖1。

圖1 48 h時3種真核質(zhì)粒在細胞中的表達

2.2陽性細胞表達數(shù)量3種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后陽性細胞在40倍視野下隨機選取6個視野之和見圖2，綠色熒光陽性細胞數(shù)量在48 h時達高峰，持續(xù)表達35 d后開始下降。

圖2 3種質(zhì)粒陽性細胞數(shù)量

圖3 細胞上清液放免檢測結(jié)果

2.3細胞上清液放免檢測結(jié)果pEGFP-C3-PENK, pIRES-GFP-sPENK重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后上清液放免檢測結(jié)果顯示48 h達高峰(852.37±76.82)pg/mL,穩(wěn)定表達32 d后開始衰減，變化規(guī)律與細胞熒光表達基本符合。動態(tài)表達見圖3。

3 討論

基因治療是隨著分子生物學(xué)與細胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展而產(chǎn)生的一種新型治療方法，它將外源性治療基因片段連接到某種載體上，轉(zhuǎn)入機體細胞內(nèi)表達，以彌補先天性基因缺陷或不足，從而起到治療作用[3]。1990年在美國成功進行了ADA(腺苷脫氨酶) 缺陷患兒的人體基因治療，開創(chuàng)了基因治療在臨床上應(yīng)用的先河。此后基因診斷與治療的研究在科研與臨床上得到廣泛的應(yīng)用。常用的基因治療方法包括基因補償、基因糾正、基因代償、反義技術(shù)等。在基因治療中目前常用的載體多為病毒性載體，該載體雖有良好的細胞轉(zhuǎn)染率與染色體整合能力，但其自身存在可控性差、自身免疫原性和潛在的致癌性等缺陷限制了其應(yīng)用[4]。真核載體外源基因整合率低，且具有低毒、低免疫原性等優(yōu)點日益得到廣泛關(guān)注。但真核載體攜帶的目的基因由于沒有整合入細胞自身基因組，不具有隨著細胞的分裂而增殖的能力，其在細胞內(nèi)的表達能力將隨細胞的增殖逐漸衰減，這決定了它們在機體內(nèi)的表達具有一定的表達時效。為驗證真核載體在細胞內(nèi)的表達時效，為今后的臨床與試驗研究提供理論依據(jù)，本試驗選用3種目前常用的3種綠色熒光真核載體轉(zhuǎn)染機體細胞，通過細胞內(nèi)綠色熒光的表達推定真核載體表達的時效，同時在pEGFP-C3、pIRES-GFP載體上連接前腦啡肽原基因，使其在細胞內(nèi)合成亮氨酸腦啡肽(L-ENK)。由于L-ENK結(jié)構(gòu)小，可以自由出入細胞膜，在體外細胞培養(yǎng)實驗中，通過放免法檢測細胞上清液中L-ENK的濃度，觀察外源基因在細胞內(nèi)的動態(tài)表達，進一步驗證綠色熒光蛋白的表達結(jié)果。實驗結(jié)果顯示3種綠色熒光載體在轉(zhuǎn)染NIN3T3細胞24 h后即開始表達，在36 h即達到高峰，隨后一直持續(xù)高表達，在35 d后其表達開始衰減，可一直持續(xù)2個月以上。L-ENK放免測定結(jié)果顯示48 h時達高峰, 穩(wěn)定表達32 d后開始衰減，變化規(guī)律與細胞熒光表達結(jié)果基本符合。根據(jù)試驗結(jié)果可得出以下結(jié)論：在基因治療中真核質(zhì)粒連接目的基因能在機體細胞內(nèi)穩(wěn)定表達約35 d，外源基因補充間隔選定為30 d較為合適。

參考文獻：

[1] Lee ES,Kim D,Youn YS,et al.A virus-mimetic nanogel vehicle[J].Angew Chem Int Ed Engl, 2008, 47(13): 2418-2421.

[2] 胡伊樂，曹靖，任秀華,等. pEGFP-C3-PENK/NIH3T3表達的腦啡肽對神經(jīng)細胞PKA表達的影響[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2010,45(2):269-272.

[3] Rizzi A,Spagnolo B,Wainford RD,et al.In vitro and in vivo studies on UFP-112, a novel potent and long lasting agonist selective for the nociceptin/orphanin FQ receptor[J].Peptides, 2007, 28(6):1240-1251.

[4] Smith RR,Martin-Schild S,Kastin AJ,et al.Decreases in endomorphin-2-like immunoreactivity concomitant with chronic pain after nerve injury[J].Neurosc,2001, 105(3):773-778.